CRISPR) is 'n derdegenerasie genoomredigeringstegniek: CRISPR het die wêreld gerevolusioneer

Gegroepeerde gereeld tussengespasieerde kort palindromiese herhalings (CRISPR) is 'n derdegenerasie genoomredigeringstegniek wat die wêreld gerevolusioneer het met sy hoë-deursetresultate. Dit is gebruik om verskeie biologiese siektes en infeksies te behandel. Verskeie bakterieë en ander prokariote (soos argea) het ook CRISPR/Cas9-stelsels om teen fage te verdedig. Daar is berig dat CRISPR/Cas9-gebaseerde strategieë die groei en progressie van drievoudige negatiewe borskanker (TNBC) kan inhibeer deur potensieel veranderde weerstandsgene, transkripsie en epigenetiese regulering te teiken. Hierdie terapeutiese intervensies kan help om uitdagende probleme soos geneesmiddelweerstand wat selfs in TNBC waargeneem word, aan te spreek. Tans word verskeie metodes gebruik om CRISPR/Cas9 aan teikenselle af te lewer, soos fisies (mikroinspuiting, elektroporasie en hidrodinamiese modusse), viraal (adeno-geassosieerde virus en lentivirus) en nie-viraal (liposome en lipied-nanopartikels). Alhoewel verskeie modelle ontwikkel is om die molekulêre oorsake van TNBC te bestudeer, beperk die gebrek aan sensitiewe en geteikende metodes vir die lewering van genoomredigeringsinstrumente in vivo hul kliniese toepassing. Samevattend ondersoek hierdie oorsig die vordering, uitdagings, beperkings en vooruitsigte van CRISPR/Cas9-behandeling vir TNBC omvattend gebaseer op bestaande bewyse. Ons beklemtoon ook hoe die kombinasie van kunsmatige intelligensie en masjienleer CRISPR/Cas9-strategieë in die behandeling van TNBC kan verbeter.
Kanker word gekenmerk deur onbeheerde seldeling, ontwrigting van selsiklus-kontrolepunte en mutasies in tumoronderdrukkergene (TSG's) (Matthews et al., 2022). Onder die verskillende tipes kanker is borskanker die mees algemene tipe kanker by vroue en het 'n hoë sterftesyfer wêreldwyd (Waks en Winer, 2019). Borskanker is 'n heterogene siekte met uiteenlopende eienskappe, soos histologiese en biologiese kenmerke, kliniese aanbieding en gedrag, en reaksie op behandeling (Weigelt et al., 2010). Borskankerklassifikasie bied presiese insigte vir borskankerdiagnose en tumorprognose. Die gebruik van algemene biomerkers en klinies-patologiese kenmerke was die hoofkriterium vir die klassifikasie van borskanker (Tsang en Tse, 2019). Die prognose en reaksie op behandeling van borskanker word beïnvloed deur talle faktore, insluitend die teenwoordigheid van estrogeenreseptor (ER), progesteroonreseptor (PR), menslike epidermale groeifaktorreseptor 2 (HER2/neu), en histologiese graad, tumortipe en graad. grootte en limfknoopmetastase (Al-Tubaiti, 2020). Vyf intrinsieke molekulêre subtipes van borskanker is geïdentifiseer, insluitend luminale A, luminale B, HER2-verryk, basaalagtig en claudin-laag (Prat et al., 2015). TNBC is 'n molekulêre subtipe van kanker wat nie alle ER, PR en HER2 uitdruk nie (Yin et al., 2020). Hierdie patologiese kenmerke word geassosieer met TNBC, wat die vinnige progressie en meer aggressiewe aard daarvan as enige ander tipe borskanker bevestig (Feng et al., 2018). Daarbenewens het Peru et al (2000) mikroarray-tegnologie gebruik om borskanker te herklassifiseer en vyf intrinsieke subtipes van borskanker te identifiseer (Cadenas, 2012). Basaalagtige borskanker is 'n subtipe van borskanker wat 'n drievoudig-negatiewe fenotipe het en met vinnige progressie geassosieer word. Daar moet kennis geneem word dat alle basaalagtige borskankers algemeen verkeerdelik as TNBC gediagnoseer word, maar slegs 77% is TNBC; In teenstelling hiermee is 71–91% van TNBC basaalagtig, wat aandui dat hierdie twee tipes borskanker oorvleuel en verskillende klassifikasies verteenwoordig (Wang D.-Y. et al., 2019). Dit skep 'n behoefte om die heterogeniteit van TNBC te karakteriseer om prognose te verduidelik en potensiële reaksies op huidige en toekomstige behandelings te identifiseer. Daarbenewens is TNBC verantwoordelik vir 15–20% van alle borskankergevalle en is dit meer algemeen by vroue onder 50 jaar oud. BRCA1- of BRCA2-mutasies is in ongeveer 20% van TNBC-gevalle aangemeld (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studies het ook getoon dat TNBC 'n duidelike immuun-mikro-omgewing het wat hoë vlakke van vaskulêre endoteelgroeifaktore, tumor-geassosieerde makrofage (TAM's), tumor-infiltrerende limfosiete (TIL's) en ander molekules wat betrokke is by tumorgroei en -migrasie insluit. Daarom is die begrip van die mikro-omgewing van TNBC van kritieke belang vir die prognose en behandeling daarvan (Fan en He, 2022).
Om die prognose van TNBC te bepaal en effektiewe behandeling te verseker, is akkurate diagnose, hoofsaaklik gebaseer op immunohistochemie (IHC) om ER, PR en HER2 op te spoor, en mammografie om borsneoplasmas op te spoor, belangrik. Mammografie kan egter nie intratumorale kenmerke soos nekrose en fibrose voldoende uitbeeld nie (Deepak Singh et al., 2021). Aangesien swak prognose en diagnose dokters verhinder om die regte medikasie voor te skryf (Chaudhary, 2020), word verskeie strategieë gebruik om sorg vir pasiënte met TNBC te verbeter. Tans word twee middels, doksorubisien en siklofosfamied, by pasiënte met TNBC gebruik en het goeie resultate getoon. Daarbenewens word ander platinummiddels gebruik, soos karboplatien en cisplatien (Sikov et al., 2015). Daarbenewens is PARP-inhibeerders soos Olaparib, Velaparib en PF-01367338 as potensiële chemoterapiemiddels vir die behandeling van TNBC gebruik (Ishino et al., 2018). Aangesien Wnt/b-Catenin-, NOTCH- en Hedgehog-seinweë berig is as betrokke by die voorkoms en progressie van TNBC, kan die teiken van medikasie op hierdie weë 'n belangrike strategie wees (Aysola et al., 2013). Alhoewel chirurgie, bestralingsterapie en chemoterapie vandag die steunpilaar van behandeling vir TNBC bly, is beduidende vordering gemaak met die ontwikkeling van nuwe behandelings, insluitend geteikende terapie, immunoterapie, verskeie CRISPR-verwante geenredigeringsinstrumente soos Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing en CRISPR/Cas9-geteikende geenterapie. Hier sal ons fokus op verskeie CRISPR-verwante geenredigeringsinstrumente wat in die behandeling van TNBC gebruik word. Onder hulle het CRISPR/Cas9 wydverspreide aandag gekry.
Cas9n, ook bekend as Cas9-nikase, is 'n geneties gemanipuleerde variant van die Cas9-proteïen afgelei van die CRISPR/Cas9-genoomredigeringstelsel (Gupta et al., 2019). In sy oorspronklike vorm bevat die Cas9-proteïen twee nukleasedomeine: RuvC en HNH, waarvan die hooffunksie die splitsing van beide DNA-stringe is. In Cas9n word een van die nukleasedomeine, HNH, egter geneties gemuteer en word dit onaktief. Daarom bly die HNH-domein van Cas9n onfunksioneel. Slegs die RuvC-domein bly aktief, wat Cas9n toelaat om enkele DNA-stringe te sny of breek te skep (Trevino en Zhang, 2014). In vergelyking met Cas9 kan Cas9n effekte buite die teiken effektief verminder en selherstelmeganismes akkuraat verbeter. Cas9n kan gebruik word om verskeie probleme op te los, soos om breek op spesifieke plekke in dubbelstrengige DNA te skep. Vir hierdie doel is twee Cas9n-molekules gekombineer en saam gebruik (Yee, 2016). Gemengde afstammingskinase 3 (MLK3) is 'n mitogeen-geaktiveerde proteïenkinase wat dien as 'n sleutelreguleerder tydens TNBC-metastase (Cronan et al., 2012).
MLK3 kan verskeie seinweë aktiveer wat lei tot TNBC-metastase. Byvoorbeeld, die c-Jun N-terminale kinase (JNK)-roete reguleer selmotiliteit en ekstrasellulêre matriksdegradasie, en MLK3 aktiveer die JNK-roete, waardeur selmotiliteit verbeter word en indringende eienskappe verleen word (Rattanasinchai en Gallo, 2016). MLK3 reguleer ook EMT. Om dit te doen, aktiveer dit stroomaf transkripsiefaktore soos Snail, Slug en Twist. Hierdie faktore inhibeer die uitdrukking van epiteelmerkers en bevorder die uitdrukking van mesenkiemale merkers, wat lei tot die verkryging van 'n metastatiese fenotipe (Casalino et al., 2023). Daar is waargeneem dat MLK3 'n rol speel in ECM-hermodellering en aktivering van proteases soos matriksmetalloproteïnases (MMP's) wat die ECM afbreek. Dit fasiliteer tumorsel-inval en verspreiding na verafgeleë plekke (Katari et al., 2019). Dus het vorige studies getoon dat MLK3 'n kritieke rol in TNBC speel. Rattanasinchai en Gallo het TNBC-modelle gebruik om die rol van MLK3 te bestudeer en het bevind dat dit kankerontwikkeling bevorder deur spesifieke seinweë. Hulle het CRISPR/Cas9n gebruik om MLK3 te redigeer en 'n beduidende vermindering in TNBC-metastase waargeneem (Rattanasinchai en Gallo, 2016).
dCas9, dikwels onaktiewe Cas9 genoem, is 'n gewysigde afgeleide vorm van die Cas9-proteïen. Anders as aktiewe Cas9, het dCas9 'n gebrek aan endonuklease-aktiwiteit, wat dit nie in staat stel om DNA-dubbelstringbreuke te veroorsaak nie. Daarom kan dCas9 gebruik word om spesifieke streke van die genoom presies te teiken sonder enige veranderinge of wysigings aan die DNA-volgorde (Wang et al., 2016). In dCas9 word twee endonukleaseproteïene, RuvC en HNH, geïnaktiveer deur belangrike aminosuurresidue te onderdruk. (Richter et al., 2016). Ten spyte van die gebrek aan DNA-splitsingsaktiwiteit, speel dCas9 'n aantal belangrike rolle in genetiese navorsing en biotegnologie. Dit laat byvoorbeeld visualisering van spesifieke streke van die genoom toe, fasiliteer transkripsieregulering en bevorder epigenetiese modifikasies (Brocken et al., 2018).
Die transkripsiefaktor ZEB1 (sinkvinger E-boksbinding homeoboks 1) speel 'n spesifieke en kritieke rol in die bemiddeling van epiteel-mesenkiemale oorgang (EMT), 'n sellulêre proses wat plaasvind tydens embrioniese ontwikkeling, weefselherstel en kankerprogressie. Dit behels die transformasie van epiteelselle in mesenkiemale selle, wat lei tot veranderinge in selmorfologie, beweeglikheid, invasiviteit, ens. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibeer verskeie epiteelselle, soos E-kadherien en Occludin, wat verantwoordelik is vir die handhawing van sel-sel adhesie en polariteit van epiteelselle in TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Daarbenewens aktiveer ZEB1 sekere merkers soos N-kadherien, vimentien en fibronektien (Konradi et al., 2014) en reguleer ook gene wat betrokke is by sitoskeletale hermodellering soos Rho GTPases en matriksmetalloproteïnases (MMP's) (Huang). et al., 2014). 2022), daarbenewens beïnvloed dit ook verskeie seinweë soos transformerende groeifaktor-β (TGF-β), Wnt-seintransduksie, ens., waardeur tumorinval en metastase in TNBC bevorder word (Chen et al., 2016). Talle studies en wetenskaplike bewyse dui daarop dat ZEB1 groot potensiaal het as 'n waardevolle middel vir die opsporing en terapeutiese intervensie van TNBC. In 'n onlangse studie het Waryah et al. 'n TNBC-model gebruik en volledige onderdrukking van ZEB1 deur dCas9 bereik. Dus het hulle baie hoë spesifisiteit en byna volledige inhibisie van ZEB1 in in vivo-toestande waargeneem (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 is 'n geenredigeringsinstrument genaamd CRISPR/Cpf1. Dit is afgelei van die CRISPR/Cas-stelsel, waar die term Cas12 verwys na CRISPR-geassosieerde proteïen 12 (Bharathkumar et al., 2022), wat heeltemal soortgelyk is aan Cas9. Die enigste verskil is dat dit die Cas12-proteïen bevat. In vergelyking met Cas9 het Cas12 'n paar unieke funksies soos die generering van klewerige punte tydens die geenredigeringsproses, terwyl Cas9 stomp punte genereer (Wang et al., 2021). Hierdie eienskap van Cas12 dra by tot sy spesifieke DNS-manipulasietegnologie. As 'n proteïen wat in staat is om teiken-DNS presies te herken en te sny, het dit buitengewone veelsydigheid, wat dit 'n effektiewe instrument maak vir 'n verskeidenheid toepassings, insluitend geenredigering (Pickar-Oliver en Gersbach, 2019).
Soortgelyk aan ander CRISPR-variante, is CRISPR/Cas12 ook in staat om gene in TNBC uit te skakel of te aktiveer, wat gene teiken wat 'n belangrike rol speel in die patogenese of reaksie op behandeling (Yang en Zhang, 2023). Om hierdie proses te bereik, is 'n gids-RNA (gRNA) ontwikkel wat Cas12 na die teikengeen rig. Sodra Cas12 aan sy teiken bind, veroorsaak dit dubbelstringbreuke in DNA en aktiveer DNA-herstelmeganismes. Tydens die herstelproses kan verkeerde nukleotiede ingesluit word, wat lei tot geenmutasies en verlies aan funksie (Zhang et al., 2021a). Daarbenewens is 'n verbeterde weergawe van die Cas12-ensiem (genoem dCas12) ook gebruik om gene te aktiveer. Deur dit met 'n transkripsieaktivator te kombineer, is dit moontlik om sekere gene te induseer en sodoende hulle te aktiveer. Hierdie tegnologie het groot potensiaal om die aktivering van tumoronderdrukkergene te bevorder (Sultan et al., 2022).
Primêre redigering is 'n nuut ontwikkelde en uiters superieure genoomredigeringstegnologie. Dit is in staat om die DNS van 'n organisme baie presies te wysig (Chen en Liu, 2023). Primêre redigering word bereik deur die integrasie van twee hoofkomponente: 'n gewysigde CRISPR/Cas9-ensiem en omgekeerde transkriptase. Die rol van die CRISPR/Cas9-ensiem is om selektief presiese plekke in die genoom te teiken, terwyl omgekeerde transkriptase help om die DNS by die teikenligging deeglik te wysig (Hassan et al., 2021). In die primerredigeringsmeganisme behels die eerste stap die skep van 'n primerredigeringsgids-RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Dit bevat die teikenvolgorde en RNS-sjabloon wat ooreenstem met die verlangde redigeringsplek in die teiken-DNS. Die pegRNA word dan saam met 'n primerredigeringsnuklease (PE2) in teikenselle ingebring. PE2 is 'n fusieproteïen wat bestaan ​​uit 'n Cas9-ensiem, 'n omgekeerde transkriptase en 'n primerredigeringsadapter (Martín-Alonso et al., 2021). Binne die sel soek pegRNA- en PE2-komplekse na die spesifieke DNS wat hulle wil wysig. Die Cas9-ensiem sny DNS en skep 'n sjabloon wat uit enkelstringe bestaan ​​(Choi et al., 2022). Omgekeerde transkriptase gebruik hierdie sjabloon om die DNS voor te berei vir redigering. Saam met die kopiëring van DNS word instruksies vir die redigering van die RNS-sjabloon ook ingesluit. Laastens word die nuutgeskepte DNS-string as 'n sjabloon gebruik om die breuk in die DNS te herstel, wat lei tot 'n veranderde DNS-volgorde wat die verlangde modifikasie bevat (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primer-redigeringsmeganismes kan lei tot wydverspreide mutasies in gene. Dit kan puntmutasies, invoegings, delesies en selfs geenvervangings teiken (Anzalone et al., 2019; Chen en Liu, 2023). Primer-redigering bied verskeie voordele bo vorige genoomredigeringstegnologieë. Dit sluit in verhoogde akkuraatheid, verminderde buite-teiken-effekte en die vermoë om DNS te wysig sonder om op DNS-dubbelstringbreuke staat te maak (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9-tegnologie is oorspronklik ontwikkel om bakterieë teen plasmied-oordrag en faaginfeksie te beskerm en is later hergebruik as 'n effektiewe RNA-gebaseerde DNA-teikeninstrument vir genoomredigering (Jiang en Doudna, 2017). Daarbenewens is berig dat die CRISPR/Cas9-stelsel teenwoordig is in onderskeidelik 50% en 87% van bakteriële en argeale genome (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 is 'n potensiële instrument vir die verwydering, invoeging en korreksie van enige abnormale genetiese volgorde deur gebruik te maak van in vivo- en in vitro-modusse (Sabit et al., 2021). Boonop is getoon dat CRISPR/Cas9 deel is van die aanpasbare immuunstelsel as gevolg van die spesifisiteit daarvan vir teikengene van belang (Chen en Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 bestaan ​​uit Cas9 en 'n enkele gids-RNA (sgRNA). Cas9 is 'n endonuklease wat uit verskeie proteïenkomponente bestaan. Daarbenewens het Cas9 unieke strukturele en konformasie-eienskappe (Pacesa et al., 2022) aangesien dit uit twee lobbe bestaan: herkenning (REC) en nuklease (NUC). Die REC-lob word verder in drie streke verdeel: REC1, REC2, en brughelikse (Cromwell et al., 2018). Die NUC bestaan ​​uit drie lobbe, naamlik RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH en die protospacer aangrensende motief (PAM) interaksiedomein (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA bestaan ​​uit twee komponente, insluitend CRISPR RNA (crRNA) en transkoderende klein RNA (spoorder RNA) (Figuur 1). Die sgRNA verbind die Cas9-proteïen aan konneksiene om 'n aktiewe kompleks te vorm, ook bekend as die effektorkompleks (Richter et al., 2012). crRNA is 'n 18-20 nukleotied basispaar wat 'n kritieke rol speel in die herkenning van teiken-DNS-reekse. Daarbenewens paar crRNA met die teiken-DNS, en tracrRNA tree op as 'n steierwerk vir die Cas9-nuklease om die teiken-DNS te bind (Manghwar et al., 2019). Aan die ander kant het die PAM-reeks 3 nukleotiede, wat die binding van die effektorkompleks aan DNS bevestig, spesifiseer en bemiddel. Die Cas9-proteïenkompleks-subeenhede RuvC en HNH het katalitiese aktiwiteit (Richter et al., 2012; Asmamaw en Zawdie, 2021). Die HNH-nukleasedomein van die Cas9-subeenheid kloof die DNS-string wat met die crRNA geassosieer word. Die RuvC-nukleasedomein klief ander DNS-stringe en genereer dubbelstringbreuke (DSB's), waarna twee verskillende DNS-breukherstelmeganismes geaktiveer word (Jiang en Doudna, 2017) (Figuur 1).
Figuur 1. Oorsig van CRISPR/Cas9 (A). Komponente van die CRISPR/Cas9-stelsel: (i). Cas9-endonuklease is verantwoordelik vir die sny van die teiken-DNS-volgorde, (ii) 'n enkele gids (sg) RNA wat voortspruit uit die fusie van crRNA en tra-crRNA-chimeras. (twee). Cas9 sluit verskeie komponente in soos Rec I, Rec II, NUC-lob (HNH en Ruv C is subkomponente) en PAM-interaksiedomein (C) met ooreenstemmende funksies. Die CRISPR/Cas9-proteïenkompleks kloof DNA-volgordes in nie-komplementêre en komplementêre vorms (D). CRISPR/Cas9 redigeer die genoom in drie stadiums: herkenning, sny en herstel. Die ontwerpte sg-RNA lei Cas9 en herken die verlangde volgorde deur die komplementêre komponent crRNA. Cas9 herken die PAM-volgorde by 5′-NGG-3′ en smelt die DNA, wat 'n DNA-RNA-hibried vorm en die klowing aktiveer. Die HNH-domein van Cas9 klief die komplementêre string, en die RuvC-domein klief die nie-komplementêre string. CRISPR/Cas9 herstel dsDNA deur dit op twee maniere te breek: nie-homoloë eindverbinding (NHEJ) en homologiegerigte herstel (HDR). NHEJ herstel dubbelstrengige DNS in die afwesigheid van vreemde homoloë DNS deur 'n ensiematiese proses, 'n foutgeneigde meganisme wat ewekansige DNS-reekse kan invoeg of verwyder. HDR is baie spesifiek en vereis homoloë DNS-templates.
CRISPR/Cas9-gemedieerde herstelpaaie sluit nie-homoloë eindverbinding (NHEJ) en homologiegerigte herstel (HDR) meganismes in. NHEJ is 'n foutgeneigde pad omdat dit invoeging of verwydering behels en geen patroon tydens die herstelmeganisme benodig nie. Dit gebruik ewekansige nukleotiede om standaardproteïene te genereer (Abbasi et al., 2021). Hierdie herstelstelsel bestaan ​​uit vier komplekse soos die KU-kompleks, die kruiskomplementerende proteïenkompleks tipe 4 (XRCC-4), die DNA-eindverwerkingsensiem en die proteïenkinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Die KU-kompleksproteïen het twee subeenhede, Ku 70 en Ku 80, en speel 'n belangrike rol in die NHEJ-meganisme, aangesien die herstelmeganisme geïnisieer word deur die binding van twee subeenhede (Ku 70 en Ku 80) aan die stomp of amper stomp punte van die teiken-DNS (Abbasi et al., 2021), wat dien as 'n steierwerk om ander NHEJ-verwante faktore na die plek van besering te lok (Yang et al., 2020). XRCC-4 en DNA-ligase bestaan ​​onderskeidelik uit 334 en 911 aminosure, en die XRCC4-DNA-ligase IV-kompleks stimuleer die ligasie van DNA-punte (Chatterjee et al., 2015). DNA-eindverwerkingsensiem, ook bekend as polinukleotiedkinase 3'-fosfaat, is 'n DNA-eindverwerkingsensiem. Dit kan die 3'P-groep in DNA verwyder en die 5'OH-groep fosforileer tydens DSB-herstel. Dit behels ook die herstel van enkelstringbreuke (SSB's) deur die SSB-herstelroete te gebruik (Chatterjee et al., 2015). Proteïenkinase DNA-PKcs is 'n DNA-afhanklike proteïenkinase wat bestaan ​​uit 'n katalitiese subeenheid van die PIKK's (fosfatidielinositol 3-kinase-verwante kinases) en ataksie-telangiektasie-gemuteerde (ATM) familie, sowel as ATM- en Rad3-verwante ATR'e, strengbreuke (DSB's) en enkelstringbreuke (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR is 'n meer akkurate en geskikte herstelmeganisme omdat die inligting gekopieer word deur die intakte vorm van die homoloë DNS-dupleks te gebruik, alhoewel dit die teenwoordigheid van susterchromatiede vereis. Dit vind plaas tydens die S/G2-fase van die soogdierselsiklus. HDR kom hoofsaaklik voor in gisspesies, maar NHEJ is krities in soogdiere (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Die volledige herstelmeganisme word in Figuur 1 getoon.
Aangesien TNBC deur genetiese en epigenetiese abnormaliteite veroorsaak word, kan die korreksie van maligne genomiese/epigenomiese abnormaliteite met behulp van CRISPR/Cas9 'n redelike terapeutiese benadering wees (Chen et al., 2019). Daarbenewens kan sommige transkripsiefaktore wat betrokke is by sel-spesifieke transkripsieregulering unieke eienskappe van kankerselle toon, wat daarop dui dat transkripsieregulering 'n uitstekende benadering vir kankerbehandeling kan wees (Drost et al., 2017). Die benutting van hierdie molekulêre kenmerke van gewasse, soos genetiese, epigenetiese en transkripsiedefekte, vir geneesmiddelontwikkeling kan kliniese uitkomste verbeter en siftingskoste verminder. CRISPR is 'n potensiële geenredigeringsinstrument wat nie net kankerveroorsakende genomiese teikens kan opspoor en identifiseer nie, maar ook gebruik kan word om onkogene in menslike selle te redigeer, onderdruk en epigeneties te wysig (Tabel 1) (Ahmed et al., 2021). Verskeie CRISPR-siftings is uitgevoer om te soek na gene wat verband hou met tumorsuppressors, onkogene en geneesmiddelweerstand. Die gebruik van CRISPR/Cas9 om verskeie TNBC-onkogene te redigeer word in Figuur 2 getoon.
Figuur 2. Geenredigering van verskeie TNBC-onkogene met behulp van CRISPR/Cas9 wat lei tot verminderde gewasgroei en metastase. Hierdie onkogene sluit in CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 en CXCR7, Crypto1, ROR1 en ST8SIA, wat betrokke is by die voorkoms en metastase van TNBC.
Kankerselmigrasie, -inval en epiteel-mesenkiemale oorgang (EMT) word geassosieer met ITGA9. Vorige studies het getoon dat ITGA9 'n sleutelspeler in die Notch-roete is en 'n interessante rol speel in rabdomiosarkoommetastase (Molist et al., 2020). Daarbenewens is gevind dat ITGA9 nou geassosieer word met pasiëntprognose in verskeie gewastipes, insluitend borskanker (Wang Z. et al., 2019). Daarbenewens het bioinformatika-analise van ITGA9 getoon dat die uitdrukking daarvan in TNBC aansienlik hoër was as in ander borskankersubtipes. Verhoogde ITGA9-vlakke word geassosieer met gewasmetastase en terugval in TNBC-pasiënte. Uitklop van ITGA9 deur CRISPR/Cas9 het gelei tot kankerstamsel (CSC)-agtige eienskappe, gewasangiogenese, gewasgroei en verminderde metastase deur β-katenien-afbraak in TNBC te bevorder (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 is 'n lid van die TGF-β-familie en is krities vir vroeë embriogenese, stamselonderhoud en kankermetastase (Ishii et al., 2021). Ook bekend as Tdgf-1, is dit 'n onkogeniese GPI-geankerde seinproteïen wat betrokke is by die regulering van die vorming van die primitiewe streep, mesoderm en endoderm, sowel as die vestiging van links/regs-asimmetrie in die ontwikkeling van liggaamsorgane tydens embriogenese (Zhang et al., 2021b). Daarbenewens is getoon dat Cripto-1 betrokke is by epiteel-mesenkiemale oorgang (EMT) as 'n stamselmerker (Zhang et al., 2021b). EMT is nie net krities vir verskeie prosesse soos embrioniese ontwikkeling, fibrose en wondgenesing nie, maar ook vir kankerinval en metastase. Daarbenewens is getoon dat Cripto-1 met vier Notch-reseptore interaksie het en hul post-translasionele volwassenheid verbeter (Brandstadter en Maillard, 2019). Die Notch-seinweg is bekend daarvoor dat dit betrokke is by die instandhouding van menslike borskankerselle. Studies het getoon dat CRISPR/Cas9-gemedieerde uitklophou van Crypto-1 kankergroei en metastase onderdruk. Daarom kan Crypto-1 'n belangrike terapeutiese teiken vir TNBC word (Castro et al., 2015).
XCL12-proteïen en sy chemokienreseptor CXC (CXCR4 en CXCR7) speel verskeie rolle in kankerselproliferasie, -groei, -migrasie en -inval (Wu et al., 2015). Hierdie chemoreseptore is geassosieer met die ontwikkeling van TNBC deur verskeie seinweë in beide in vivo en in vitro modelle (Wu et al., 2015). Daarbenewens word aktivering van CXCR4 en CXCR7 geassosieer met groter vatbaarheid vir metastase en swak prognose in TNBC (Karn et al., 2022). Daarom kan die uitklophou van CXCR4 en CXCR7 effektiewe geneesmiddelteikengene word vir die behandeling van borskanker, insluitend TNBC. Studie deur Yang et al. Yang et al (2019) het CRISPR/Cas9 gebruik om die CXCR4- en CXCR7-gene mede-uit te skakel en het bevind dat TNBC-proliferasie, -groei, -migrasie en -inval beduidend geïnhibeer is (Yang et al., 2019).
Verhoogde vlakke van miR-3662, 'n TNBC-onkogeen, is in borskankerweefsel waargeneem (Yi et al., 2022). Daar is getoon dat die onderdrukking van miR-3662 borskankertumorgroei en -metastase inhibeer, beide in vivo en in vitro (Agarwal en Gupta, 2021). HBP-1 is 'n kragtige inhibeerder van Wnt/-katenien-seintransduksie en is waarskynlik verantwoordelik vir miR-3662-gemedieerde groei van TNBC-selle. Onlangs het Yi et al. bevind dat die miR-3662-HBP1-as die Wnt/-katenien-seintransduksieroete in TNBC-selle reguleer (Yi et al., 2022). As gevolg van sy tumorspesifieke uitdrukking, kan miR-3662 'n potensiële terapeutiese teiken vir TNBC wees. Dus kan CRISPR/Cas9-gemedieerde onderdrukking van miR-3662 'n uitstekende benadering wees vir die ontwikkeling van nuwe middels vir die behandeling van TNBC.
UBR5 is 'n 300 kDa nukleofosfoproteïen wat geïdentifiseer is as 'n sleutelreguleerder van tumorigenese, metastase en immuunrespons in verskeie kankers (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Daar is berig dat UBR5 hoogs opgereguleer is in TNBC-monsters en stimuleer ERα-funksie deur proliferasie te induseer deur sy ubikwitienligase-aktiwiteit (Bolt et al., 2015). Studies van primêre TNBC-monsters met volledige eksoomvolgordebepaling het ook verhoogde uitdrukking van UBR5 getoon, wat daarop dui dat dit 'n rol in die ontwikkeling van TNBC speel. Daarbenewens het CRISPR/Cas9-gedrewe delesie van UBR5 beduidende inhibisie van TNBC-metastase en -groei in eksperimentele muismodelle getoon. Boonop het die insluiting van UBR5 in 'n wildetipe-muismodel sy volle funksionaliteit herstel, terwyl hierdie effek nie waargeneem is in geïnaktiveerde mutantstamme nie (Liao et al., 2017). 'n Gebrek aan UBR5 word geassosieer met verhoogde apoptose, nekrose en inhibisie van gewasgroei in TNBC as gevolg van swak angiogenese. As gevolg van die verlies aan UBR5 word gewasverspreiding na verre organe verminder, en UBR5 veroorsaak abnormale EMT hoofsaaklik deur E-cadherin-uitdrukking te verminder (Zhang en Weinberg, 2018). Onlangs is getoon dat UBR5 'n baie belangrike faktor in IFN-γ-geïnduseerde PDL1-transkripsie in TNBC is as gevolg van die gebrek aan E3-ubikwitinasie-aktiwiteit. RNA-transkriptoom-analise het aan die lig gebring dat UBR5 sistemiese effekte op gene wat met die IFN-γ-roete geassosieer word, kan hê en PDL1-transaktivering kan bevorder deur die aktiveringsvlakke van proteïenkinase RNA (PKR) en sy seintransduktors en aktiveerders te verhoog. transkripsie 1 (STAT1) en interferon-regulatoriese faktor 1 (IRF1). CRISPR/Cas9-gemedieerde gekombineerde ablasie van UBR5- en PD-L1-ekspressie het egter 'n sinergistiese terapeutiese effek as enige blokkade alleen, met diepgaande effekte op die tumor-mikroomgewing (Wu et al., 2022). Dus kan CRISPR/Cas9 'n belangrike instrument wees om UBR5-funksie te inhibeer, en sodoende TNBC-metastase en tumorgroei te onderdruk.
ROR1 is 'n tipe I transmembraanproteïen wat tydens kanker en embrioniese ontwikkeling uitgedruk word en is geïdentifiseer as 'n onkofetale proteïen (Nicholas Borcherding, 2014). Die indringende gedrag van verskeie menslike kankers word geassosieer met die opregulering van ROR1. Belowende resultate is verkry uit in vivo en in vitro studies wat terapeutiese verbindings behels wat ROR1 teiken (Chien et al., 2016). Verhoogde vlakke van ROR1 mRNA in borsweefselbiopsieë is ook geassosieer met aggressiewe basaalagtige bors (BL) gewasse en hul migrasie na ander dele van die liggaam. Verder is oorekspressie van ROR1 geïdentifiseer as 'n prognostiese merker vir die ontwikkeling van TNBC (Chien et al., 2016). Die stilmaak van ROR1 met behulp van CRISPR/Cas9 om TNBC-groei en metastase te onderdruk, sou egter 'n effektiewe strategie wees.
Die sialileringsproses behels die byvoeging van sialiensuur tot glikokonjugate, wat deur sialieltransferases (ST's) gekataliseer word. ST8SIA1 behoort tot die ST-familie en speel 'n belangrike rol in die patogenese van verskeie siektes soos limfositiese leukemie en kolorektale kanker (Chang et al., 2018). RNA-volgorde-analise toon dat ST8SIA1 hoogs uitgedruk word in borsweefsel van TNBC-pasiënte en positief gekorreleer is met mutasies in die tumorsuppressorgeen p53, wat kan bydra tot die patogenese van TNBC (Battula et al., 2017). Daarbenewens is ST8SIA1 betrokke by die metastase en herhaling van TNBC, wat daarop dui dat dit 'n belangrike rol speel in die voorkoms en ontwikkeling van TNBC. In 'n in vitro-model van TNBC is getoon dat die onderdrukking van ST8SIA1 deur CRIPSR/Cas9 groei en metastase blokkeer (Battula et al., 2017). Dit dui daarop dat CRISPR/Cas9 'n belangrike instrument kan wees om die funksie van die ST8SIA1-onkogeen in die behandeling van TNBC te inhibeer.
NAT1 is 'n metaboliese ensiem wat die vorming van fase II xenobiotiese verbindings kataliseer en word in byna alle menslike weefsels uitgedruk. NAT1 kan die kofaktor folaat gebruik om asetiel-CoA (asetiel-CoA) te teiken, selfs in die afwesigheid van die aromatiese amiensubstraat (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studies het getoon dat NAT1 matriksmetalloproteïnase 9 (MMP9) funksie in borskankerselmodelle reguleer en beskerm teen reaktiewe suurstofspesies (ROS) tydens glukose-hongersnood (Wang et al., 2018). Skrapping van NAT1 het getoon dat dit die piruvaatdehidrogenasekompleks inhibeer, wat lei tot mitochondriale disfunksie (Wang L. et al., 2019). Daarbenewens het verskeie ander verslae getoon dat NAT1-inhibisie met behulp van klein molekules en siRNA-stilmaak die invasiviteit en proliferasie van borskankerselle kan verminder (Stepp et al., 2018). Onlangs is CRISPR/Cas9 gebruik om NAT1 in die borskanker-sellyn MDA-MB-231 te onderdruk, wat sellulêre metabolisme beïnvloed afhangende van die uitdrukkingsvlak daarvan. Hierdie studie het ook getoon dat NAT-1 krities is vir die progressie en metastase van TNBC (Carlisle et al., 2020).
Gekoördineerde transkripsie van onkogene word gereguleer deur superversterkers, transkripsiefaktore en kofaktore (Hnisz et al., 2015). Daarbenewens is 'n groep siklien-afhanklike kinases (CDK's), soos CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 en CDK13, nodig vir transkripsieregulering. Onder hulle is CDK7 betrokke by die fosforilering van RNA-polimerase II, wat baie belangrik is vir die inisiëring en uitbreiding van onkogeentranskripsie in die patogenese van TNBC. In 'n belangrike studie het die verwydering van CDK7 deur CRISPR/Cas9 TNBC geïnhibeer, wat aandui dat die patogenese van TNBC CDK7-afhanklik is (Wang Y. et al., 2015).
Studies het getoon dat mutasies in MYC en RBP (RNA-bindende proteïen) tot apoptose kan lei, terwyl enkelgeenmutasies in MYC of RBP nie die groei van kankerselle beïnvloed nie (Einstein et al., 2021). Meer as 1000 RBP's in die menslike genoom is gekeur met behulp van 'n CRISPR/Cas9-gebaseerde biblioteek. Onder hulle is 57 RBP's gevind wat krities is vir die groei van kankerselle met hoogs verhoogde MYC-vlakke (Wheeler et al., 2020). Daarbenewens is YTHDF2 belangrik vir die handhawing van TNBC-selgroei en verminder die hoeveelheid gemetileerde transkripsies tydens hoëvlak-transkripsie en translasie in kankerselle met hoër MYC-uitdrukking. Daarbenewens is YTHDF2 nie noodsaaklik vir kankerselle nie, wat minder afhanklik is van verhoogde MYC-vlakke om die oorlewing van TNBC-pasiënte te verleng (Einstein et al., 2021), wat daarop dui dat dit 'n potensiële terapeutiese teiken vir middels kan wees wat TNBC kan oorkom.
Sinkvingerproteïene (ZNF's) maak ongeveer 1% van die totale menslike genoom uit. Studies het getoon dat ZNF selproliferasie in verskeie kankers, soos lewerkanker, borskanker en kolorektale kanker, kan reguleer (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Biblioteke wat deur CRISPR-uitklop gegenereer is, is gebruik om verskeie tumorsuppressorgene (TSG's) in borskankerselle te sif (Shalem et al., 2014). Sedertdien het 'n transkriptomiese studie van CRISPR/Cas9 ZNF319-geskrapte borskankerselle getoon dat ZNF319 'n tumorsuppressorgeen is wat borskankerproliferasie verminder en dus betrokke is by verskeie potensiële seinmeganismes en ander biologiese funksies (Wang L. et al., 2022).
Ferroptose is 'n tipe geprogrammeerde seldood wat afhanklik is van die teenwoordigheid van yster. Dit is bekend dat die ontwikkeling van ferroptose beïnvloed word deur die teenwoordigheid van lipiedperoksiede. Daarbenewens is berig dat PKCβII vroeë lipiedperoksidasie toon, en verhoogde lipiedperoksidasie word geassosieer met ferroptose. Deur 'n biblioteek van CRISPR/Cas9-gemedieerde kinase-inhibeerders te ondersoek, is aan die lig gebring dat PKCβII betrokke is by die proses van lipiedperoksidasie, wat krities is vir ferroptose in MDA-MB-231-selle (Zhang et al., 2022). Dit dui dus daarop dat die uitskakeling van PKCβII deur CRISPR/Cas9 'n potensiële tumoronderdrukkergeen-teiken kan wees vir die behandeling van ferroptose-verwante siektes (Zhang et al., 2022).
Daar word geglo dat geneesmiddelweerstand verantwoordelik is vir ongeveer 90% van sterftes by kankerpasiënte en is een van die grootste uitdagings in kankerbehandeling (Bukowski et al., 2020). Die resultate dui daarop dat 'n voldoende aantal gene wat verband hou met geneesmiddeluitvloei, DNS-herstel, apoptose en verskeie selseinweë geassosieer word met geneesmiddelweerstand (Haider et al., 2020). Onder hulle is verskeie gene geteiken deur CRISPR/Cas9-instrumente en het belowende resultate getoon in die vermindering van geneesmiddelweerstand en die verhoging van die doeltreffendheid van antikankerbehandelings (Vaghari-Tabari et al., 2022). Daarbenewens is hoë-deurset CRISPR/Cas9-geen-uitklop-siftingsbiblioteke geïmpliseer in die wysiging van die funksie van potensiële geneesmiddelweerstandsgeenteikens (Shalem et al., 2015). Om paklitaksel-weerstandsgene te identifiseer, is RNA-volgordebepaling gekoppel aan genoomwye sgRNA-biblioteeksifting gebruik om agt kandidaatgene, insluitend histoon-deacetylase 9 (HDAC9), te identifiseer wat geassosieer word met geneesmiddelweerstand in pasiënte met herhalende TNBC (B et al., 2020). In 'n ander studie is verhoogde uitdrukking van diserine/treonine en tirosienproteïenkinase (DSTYK) waargeneem tydens die oorlewing van TNBC-pasiënte wat met antikankermiddels behandel is. Boonop het CRISPR/Cas9-gemedieerde afskakeling van DSTYK apoptose van geneesmiddelweerstandige kankerselle in vitro (SUM102PT-selle en MDA-MB-468-selle) en 'n in vivo TNBC-model aansienlik verbeter (Ogbu et al., 2021).
Alhoewel TNBC abnormale aktivering van die MAPK-roete het, is die kliniese effek van MEK-geteikende terapieë swak. 'n CRISPR/Cas9 genomiese biblioteeksifting het aan die lig gebring dat inhibisie van PSMG2 (proteoomsamestellingschaperone 2) TNBC BT549- en MB468-selle sensitiseer vir die MEK-inhibeerder AZD6244. CRISPR/Cas9-onderdrukking van PSMG2 het normale proteasoomfunksie verander, wat lei tot outofagie-gemedieerde disassemblering van PDPK1, en sodoende tumorselle in TNBC-muismodelle wat deur AZD6244 (MEK-inhibeerder) en MG132 (proteasoom-inhibeerder) geïnduseer word, verder verbeter. Dus kan proteasoom- en MAP-kinase (MEK)-inhibeerders sinergisties toegedien word om tumorselproliferasie te verminder (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 is ook gebruik om te sif vir verlies van geenfunksie wat lei tot TNBC-weerstandigheid (Shu et al., 2020). Ge et al. het die meganisme van geneesmiddelweerstandigheid van kankerselle wat behandel is met JQ1, 'n BET-bromodomein-inhibeerder (BBDI), in TNBC verduidelik. Deur CRISPR/Cas9 te gebruik, het hulle gevind dat die verwydering van die rb1-geen veroorsaak het dat TNBC weerstandig word teen die antikankermiddel JQ1. Daarom is rb1-funksie belangrik in die reaksie op JQ1-middels in TNBC. Hulle het ook berig dat paklitaksel 'n CDK4/6-kinase/mikrotubuli-inhibeerder is, en die kombinasie daarvan met BBDI's soos JQ1 kan belowende terapeutiese reaksies op geneesmiddelweerstandige TNBC bied (Ge et al., 2020).
Daar is berig dat die transkripsielandskap van lang nie-koderende RNS (lncRNA) verantwoordelik is vir weerstand teen neoadjuvante terapie in TNBC. Hierdie studie toon dat vyf verskillende MALAT1 lncRNA-transkripte hoogs uitgedruk word in TNBC. Daarbenewens het CRISPR/Cas9-gemedieerde delesie van MALAT1 die sensitiwiteit van TNBC BT-549-selle vir paklitaksel en doksorubisien verhoog, wat 'n potensiële rol vir MALAT1-weerstand in TNBC voorstel (Shaath et al., 2021).
Mutasies in BRCA1 (BRCA1m) is heterogeen en dus moeilik om op te spoor. Die teiken van PARP1 (poli(ADP-ribose) polimerase), die sintetiese letale vennoot van BRCA1, kan die chemosensitiwiteit van TNBC-middels verhoog. Deur CRISPR/Cas9 te gebruik, het die verwydering van PARP1 die sensitiwiteit van antikankermiddels soos doksorubisien, gemsitabien en dosetaksel vir mBRCA1-mutant TNBC-selle verhoog, wat daarop dui dat PARP1 ook betrokke is by geneesmiddelweerstand in TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutasies in die tumoronderdrukkergene BRCA1 of BRCA2 is bekend daarvoor dat hulle die waarskynlikheid van borskanker by mense verhoog. Behandeling van hierdie pasiënte vereis die gebruik van PARP-inhibeerders. Daarbenewens is daar gedemonstreer dat die uitskakeling van die nukleotied-reddingfaktor DNPH1 met behulp van CRISPR/Cas9 die giftige nukleotied 5-hidroksimetieldeoksiuridien (hmdU) monofosfaat kan verwyder, waardeur die reaksie van BRCA-gebrekkige selle op sensitiwiteit vir PARP-inhibeerders verbeter word (Fugger et al., 2021). Dus kan CRISPR/Cas9 en PARP1-inhibeerders 'n belangrike behandelingsstrategie vir TNBC word.
Die penetrerende glikoproteïen (P-gp) geen is 'n multidwelmweerstandsgeen wat oor die algemeen opgereguleer word in ongeveer 41% van alle TNBC (Sun et al., 2020). P-gp-geïnduseerde geneesmiddel-effluks is geïdentifiseer as 'n sleutelreguleerder van geneesmiddelweerstand in borskanker. P-gp-inhibeerders het verhoogde sensitiwiteit vir antikankermiddels in borskanker getoon (Famta et al., 2021). Dus kan CRISPR/Cas9-gemedieerde ablasie of onderdrukking van P-gp en P-gp-inhibeerders baie belangrike metodes wees om geneesmiddelweerstand in TNBC te oorkom.
ATP-bindende kassettransporter G2 (ABCG2) is bekend daarvoor dat dit geneesmiddelweerstandigheid in TNBC veroorsaak (Palasuberniam et al., 2015), hoewel daar tans geen verslae is oor die verband tussen CRISPR/Cas9 en ABCG2-stilmaak en tumorsuppressorgeeninaktivering nie. PTEN kan ABCG2-aktivering verbeter (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Daarom kan die gebruik van CRISP/Ca9 om ABCG2 te verwyder en dit met 'n ABCG2-inhibeerder te kombineer 'n geskikte behandeling wees om geneesmiddelweerstandigheid in TNBC te oorkom. Tabel 2 noem CRISPR/Cas9 wat alle weerstandsgene teiken.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 teiken verskeie TNBC-weerstandsgene om selle sensitief te maak vir antikankermiddels.
CRISPR/Cas9-biblioteke is potensiële instrumente vir die sifting van geenmutasies wat met kankerpatogenese geassosieer word (Chan et al., 2022). Hierdie siftingsmetode behels vier stappe soos (a) biblioteekkonstruksie, (b) lentivirale transduksie, (c) fenotipiese sifting, en (d) teikengeenanalise. Alhoewel TNBC abnormale aktivering van die MAPK-roete het, is die kliniese prognose van MEK-geteikende terapie vir TNBC-pasiënte wat mutasies in tumorsuppressorgene soos PTEN, RB1 en TP53 dra, baie swak.
Daarbenewens het 'n geen-uitkloptoets met behulp van CRISPR/Cas9 die kragtigste en selektiewe molekule, dehidrokatrol, wat volop in Guatemalteekse blom- en blaarekstrakte voorkom, getoets om die effek van dehidrokatrol op MDA-MB-231 te verstaan. Meganismes van selektiewe selsitotoksisiteit. Mesenkiemale stamkarakteristieke van TNBC-subtipes. Hierdie CRISPR/Cas9-gebaseerde toets het ook aan die lig gebring dat HSD17B11, 'n geen wat kodeer vir 17β-hidroksisteroïeddehidrogenase tipe 11, hoogs uitgedruk word in MDA-MB-231-selle en lei tot dehidrofalkarinol spesifiek vir MDA-MB-231-selle (Grant et. al., 2020). Dit dui dus daarop dat CRISPR/Cas9 genomiese toetsing groot potensiaal het om die meganismes onderliggend aan die antikanker-eienskappe van potensiële natuurlike verbindings te identifiseer.
Daarbenewens is die kwesbaarheid van TNBC vir kanker bestudeer met behulp van 'n onbevooroordeelde genoomwye in vivo CRISPR/Cas9-sifting, wat 'n verband tussen onkogeniese en tumoronderdrukkende bane getoon het. Daar is berig dat sleutelkomponente van die mTOR- en Hippo-bane belangrike rolle speel in tumorregulering in TNBC. Daarbenewens het studies getoon dat farmakologiese inhibisie van mTORC1/2 en YAP-onkoproteïen die patogenisiteit van TNBC effektief inhibeer deur 'n in vitro-dwelm-matriks-sinergiemodel en in vivo pasiënt-afgeleide xenografte te gebruik. Boonop verhoog Torin-1-gemedieerde mTORC1/2-inhibisie makropinositose, terwyl verteporfin-geïnduseerde YAP-inhibisie lei tot TNBC-seldood. Saamgevat beklemtoon hierdie resultate die krag en robuustheid van genoomwye in vivo CRISPR-sifting om nuwe en effektiewe behandelings vir TNBC te identifiseer (Dai et al., 2021).
Disregulering van die immuunstelsel is 'n belangrike faktor in tumorgenese. Kankerselle ontduik immuunklaring deur verdedigingsmeganismes te omseil, insluitend die aktiwiteit van immuunselle in die tumor-mikroomgewing te belemmer en die immuunstelsel in gevaar te stel. Daarom kan die ontwikkeling van 'n verbeterde immuunstelsel 'n sleutelbenadering wees om gewasse te bestry. Die gebruik van CRISPR/Cas9-gebaseerde geenmodifikasie spreek verskeie kwessies aan wat verband hou met immuundisfunksie vanuit verskillende perspektiewe. CRISPR/Cas9 is gebruik om antitumor-immuniteit teen borskanker te verbeter deur die volgende weë (Figuur 3).
Figuur 3. CRISPR/Cas9 immunoterapie teiken TNBC-selle. Verlies van CDK5 en die afskakeling van PDL1 en CD155 versterk die immuunstelsel. Net so het die verlies van A2AR en die afskakeling van TAA's soos HER2, mucin 1 en TEM8 die doeltreffendheid van CAR-T-selle in die doodmaak van kankerselle verhoog. CRISPR/Cas9-gedrewe T-selsifting het getoon dat ontwrigting van p38-kinase T-sel-antitumoraktiwiteit verbeter. T-selle wat deur CRISPR/Cas9 gemodifiseer is, verhoog die uitdrukking van TCR (T-selreseptor), wat daartoe lei dat T-selle antitumoraktiwiteit het.
Die doel van immunoterapie is om die immuunstelsel te stimuleer om kankerselle aan te val. Oorekspressie van immuunkontrolepuntproteïene voorkom gewoonlik outo-immuunreaksies, maar kan kankers help om dit te vermy (Topalian et al., 2015). Hierdie proteïene voorkom immuunreaksies deur te bind aan reseptore op die oppervlak van immuunselle. Verskeie kontrolepuntproteïene (soos CD155 en PD-L1) teiken die PD-1-reseptor op immuunselle en word uitgedruk in borskanker, veral TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Die onderdrukking van PD-L1 of sy reseptor met behulp van CRISPR/Cas9 kan die immuunstelsel stimuleer om TNBC-gewasse aan te val (Yahata et al., 2019). Daarbenewens is getoon dat afregulering van PD-L1-ekspressie deur CRISPR/Cas9-gemedieerde delesie van CDK5 gewasgroei in vitro en in vivo inhibeer (Deng et al., 2020). Groei-inhibisie in in vitro- en in vivo-modelle van borskanker dui daarop dat shRNA-gemedieerde reduksie van CD155 'n terapeutiese effek op borskanker kan hê (Gao et al., 2018).
CAR T-selle druk CAR'e uit wat tumor-geassosieerde antigene (TAA's) herken en kan die afskakeling van kontrolepuntproteïene gebruik om hul aktiwiteit te verbeter (Li C. et al., 2020). Daar is verskeie potensiële teikens vir CAR T-selterapie in borskanker, insluitend verskeie TAA's soos HER2, mucin1 en TEM8 (Bajgain et al., 2018). Daar is bewyse dat CAR T-selle wat mesotelien teiken (ooruitgedruk in TNBC BT-459-selle) meer effektief teen kanker is wanneer PD-1 uitgeskakel word met behulp van CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Die isolering van T-selle van pasiënte en die redigering daarvan ex vivo is egter 'n arbeidsintensiewe en tydrowende proses. Alhoewel universele T-selle isolasievereistes kan verminder, moet skenker-T-selle wat menslike leukosiet-antigeen (HLA) klas I en T-selreseptor (TCR) uitdruk, verwyder word om oorplanting-versus-gasheer-abnormaliteite te voorkom (Ren et al., 2017, 2017a). Deur CRISPR/Cas9 te gebruik, kan HDR gelyktydig TCR en HLA elimineer en die geen wat vir CAR kodeer, uitskakel. Studies het getoon dat CRISPR/Cas9 gebruik kan word om anti-CD19 CAR's in die TCR-lokus in te voer, waardeur CAR's doeltreffend geproduseer word sonder om T-selle uit te put (Dimitri et al., 2022). Multiplex-tegnologieë is ontwikkel om allogene CAR T-selle te genereer deur gelyktydig TCR, beta-2-mikroglobulien (B2M), HLA-I-subeenheid en ander proteïene soos PD-1 en CTLA-4 te elimineer, wat moontlik groter antikanker-eienskappe teen TNBC het (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Die gebruik van CRISPR/Cas9 kan die doeltreffendheid van CAR-T-selle verbeter. Adenosien is bekend daarvoor dat dit immuunonderdrukkende eienskappe het en kan antikanker-immuniteit verminder deur T-selfunksie te blokkeer en adenosien A2A-reseptore (A2AR) te aktiveer (Vigano et al., 2019). Die stilmaak van A2AR met behulp van CRISPR/Cas9 het die doeltreffendheid van CAR-T-selle in vivo aansienlik verbeter (Giuffrida et al., 2021). T-selle is bekend daarvoor dat hulle verskeie fenotipiese eienskappe soos sellulêre uitbreiding, differensiasie, oksidatiewe stres en genomiese stres vertoon. CRISPR/Cas9-gebaseerde T-selsifting het die ontwrigting van 25 verskillende T-selreseptorkinases aan die lig gebring. Onder hulle is getoon dat die verwydering van p38-kinase die antitumoraktiwiteit van T-selle verbeter, wat aandui dat p38-kinase 'n sleutelreguleerder van CAR-T-selregulering is (Gurusamy et al., 2020).
T-selle kan geneties gemodifiseer word deur CRISPR/Cas9 te gebruik om hoogs uitgedrukte TCR's te produseer. Die oordrag van geneties gemodifiseerde T-selle na pasiënte het sterker antikankeraktiwiteit getoon as endogene T-selle. Daarom kan endogene TCR's meeding met geneties gemodifiseerde TCR's in pasiënte, wat die potensiaal van kanker-immunoterapie kan beïnvloed. Om hierdie probleem te oorkom, kan die gebruik van CRISPR/Cas9 om endogene TCR-β in ontvangerselle te verwyder en daarna TCR-β T-selle na kankerpasiënte oor te dra, beter antikanker-immuunresponse toon sonder die behoefte aan endogene TCR seksuele kompetisie (Fan et al. 2018). Dus, met die uitsondering van CRISPR-gemodifiseerde T-selle, is TCR's 'n duisend keer meer sensitief vir tumor-antigene as normale TCR-getransduseerde T-selle. Daarbenewens toon veranderde T-selle wat deur γδ TCR+ CRISPR gegenereer word, in verskeie leukemieë hoër uitdrukking van CD4+ en CD8+ T-selle as standaard TCR-oordrag (Legut et al., 2018). Dus kan gemodifiseerde T-selle wat deur CRISPR/Cas9 gegenereer word, 'n effektiewe immunoterapie-metode wees om TNBC te oorkom.
Integrine is seladhesiemolekules wat in sellulêre transmembrane teenwoordig is en die binding van selle aan die ekstrasellulêre matriks (ECM) bevorder (Hamidi en Ivaska, 2018). Disregulering van integrine word geassosieer met kankerontwikkeling en -migrasie deur die ekstrasellulêre matriks te verander, wat lei tot kankerseloorlewing in die sirkulasie (Hamidi en Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-gemedieerde integrin-uitklop vertraag tumorprogressie, metastase en kolonisasie in TNBC. Daar is berig dat die uitklop van integrin a5 (ITGA5) selmigrasie en -progressie in ander kankers soos longkanker verminder (Ju et al., 2017), wat daarop dui dat integrin a5 ook 'n sleutelfaktor in die patogenese van TNBC kan wees.
Die generering van knockout-muise met behulp van tradisionele embrioniese stamsel (ES)-selmetodes is 'n arbeidsintensiewe, tydrowende en ondoeltreffende proses. Dit neem maande en jare om ES-selle deur homoloë rekombinasie te teiken, chimeriese muise te teel en hulle dan met heterosigotiese muise te kruis om homosigotiese nageslag te produseer. Komplekse kruisteling is nodig om muise met veelvuldige genetiese mutasies te skep. Baie probleme het egter ontstaan ​​wanneer muise gebruik word wat gegenereer is deur ablasie van ES-selle met behulp van CRISPR/Cas9 of deur mikro-inspuiting van CRISPR/Cas9-komponente in enkelsel-bevrugte eiers. Byvoorbeeld, die invoering van veranderinge vind dikwels by bialleliese loci plaas en is nie geenspesifiek nie. Daar is onlangs berig dat ES-selle wat CRISPR/Cas9-tegnologie gebruik, gelyktydig bialleliese mutasies in tot 5 gene kan invoeg (Nishizono et al., 2021). Vir hierdie doel is Cas9 mRNA en vyf geenspesifieke gRNA's gelyktydig in ES-selle getransfekteer. Dit beklemtoon die belofte en doeltreffendheid van hierdie prosedure, hoewel hierdie mutasies moontlik oorgedra is toe stigterslyne geteel is om vyfvoudige uitklopmuise te produseer. Die studie rapporteer ook 'n verrassende ontdekking: ES-selle is nie meer nodig om geneties gemodifiseerde muise te skep nie. In plaas daarvan, om spesifieke geenprodukte te verwyder, is Cas9 mRNA en gRNA in enkelselstadium-embrio's ingespuit. Gevolglik is uitklop-stigterslyne geskep wat teoreties gebruik kan word om die gevolge van geen-delesie in muise te bestudeer (Qin et al., 2016). Dus laat CRISPR/Cas9 die skepping van transgeniese muise toe om TNBC teen 'n laer koste as tradisionele genetiese manipulasie te behandel. Deur die CRISPR/Cas-stelsel te gebruik, is 'n nuwe uitklopmuismodel ontwikkel wat suksesvol puntmutasies in een of meer endogene gene in TNBC kan inbring. Gebaseer op hierdie konsep, kan diermodelle van TNBC ook ontwikkel word deur gebruik te maak van CRISPR/Cas9-gemedieerde delesie van BRCA1 en p53, wat lei tot verlies van HR-herstel, genomiese onstabiliteit en mutante fenotipes (Annunziato et al., 2020).
Tans word verskeie metodes soos mammografie, magnetiese resonansiebeelding (MRI) en ultraklank gebruik om TNBC te diagnoseer. Hierdie metodes het egter sekere beperkings. Mammografie word gebruik om plaaslike borsweefsel te diagnoseer eerder as metastases, waar kankerselle na ander organe gemigreer het. Ultrasonografie is nie 'n betroubare metode vir die diagnose van TNBC nie (Chen en Lee-Felker, 2023). MRI het hoër sensitiwiteit as ultraklank en mammografie, maar die diagnostiese akkuraatheid daarvan is beperk (Sha en Chen, 2022). Weefselbiopsie is 'n indringende manier om kankerselle te identifiseer. In sommige gevalle kan 'n biopsie egter kankerweefsel mis as die naald van die betrokke area afdwaal. Boonop is dit baie duur en kan dit traumaties vir die pasiënt wees. TNBC is 'n heterogene tipe kanker, dus 'n biopsie verskaf moontlik nie genoeg inligting oor die tipe kanker nie. Daarom is 'n nuwe diagnosties betroubare metode vir die opsporing van TNBC dringend nodig. CRISPR/Cas9 kan dien as 'n hoogs sensitiewe en minimaal indringende alternatief vir borskankerdiagnose. Vir hierdie doel kan CRISPR/Cas9-gebaseerde strategieë gebruik word om PCR-metodes vir die diagnose van TNBC te verbeter. Eerstens word die Cas9- en cpf1-proteïene van die CRISPR-stelsel gebruik om nie-spesifieke DNA te verwyder, en dan kan hierdie twee proteïene (Cas9 en cpf1) die PAM-volgorde herken voordat dit aan die teiken-DNS bind (Deepak Singh et al., 2021). Dus kan PCR mutasies identifiseer wat met kankerontwikkeling geassosieer word. Verskeie studies het hierdie CRISPR-gebaseerde strategie aangeneem om verskillende mutasies in verskillende kankers op te spoor (Safari et al., 2019). Dus kan CRISPR-gebaseerde PCR-metodes die afhanklikheid van TNBC-diagnose van indringende metodes soos biopsie-gebaseerde immunohistochemie verminder.
Genotipiese veranderinge in hormoonreseptorregulering is ook in TNBC gedemonstreer (Chen en Russo, 2009). CRISPR/Cas9-gebaseerde PCR-strategieë wat mikro-skikkings vir punt-van-sorg-diagnostiek gebruik, kan hierdie mutasies effektief monitor (Hajian et al., 2019). Dit kan ook gesondheidsorgverskaffers van relevante inligting voorsien oor spesifieke mutasies in TNBC-pasiënte, wat kan help om hul behandelingsverloop te verbeter. Hierdie gekombineerde tegniek het egter beperkings. Daarom is uitgebreide navorsingspogings nodig voordat hierdie CRISPR/Cas-PCR-metode in gesondheidsorg gebruik kan word vir die diagnose van TNBC (Yang et al., 2019).