Differensiële diagnose van pulmonale nodules wat deur rekenaartomografie (CT) geïdentifiseer word, bly 'n uitdaging in die kliniese praktyk. Hier karakteriseer ons die globale metaboloom van 480 serummonsters, insluitend gesonde kontroles, goedaardige longnodules en stadium I longadenokarsinoom. Adenokarsinome vertoon unieke metabolomiese profiele, terwyl goedaardige nodules en gesonde individue hoë ooreenkoms in metabolomiese profiele het. In die ontdekkingsgroep (n = 306) is 'n stel van 27 metaboliete geïdentifiseer om te onderskei tussen goedaardige en kwaadaardige nodules. Die AUC van die diskriminantmodel in die interne validerings- (n = 104) en eksterne validerings- (n = 111) groepe was onderskeidelik 0.915 en 0.945. Padanalise het verhoogde glikolitiese metaboliete geassosieer met verminderde triptofaan in longadenokarsinoomserum getoon in vergelyking met goedaardige nodules en gesonde kontroles, en het voorgestel dat triptofaanopname glikolise in longkankerselle bevorder. Ons studie beklemtoon die waarde van serummetaboliet-biomerkers in die beoordeling van die risiko van pulmonale nodules wat deur CT opgespoor word.
Vroeë diagnose is van kritieke belang om oorlewingsyfers vir kankerpasiënte te verbeter. Resultate van die Amerikaanse Nasionale Longkanker-siftingsproef (NLST) en die Europese NELSON-studie het getoon dat sifting met lae-dosis rekenaartomografie (LDCT) longkankersterftes in hoërisikogroepe aansienlik kan verminder1,2,3. Sedert die wydverspreide gebruik van LDCT vir longkanker-sifting, het die voorkoms van toevallige radiografiese bevindinge van asimptomatiese pulmonale nodules bly toeneem4. Pulmonale nodules word gedefinieer as fokale ondeursigtighede tot 3 cm in deursnee5. Ons ondervind probleme om die waarskynlikheid van maligniteit te bepaal en die groot aantal pulmonale nodules wat toevallig op LDCT opgespoor word, te hanteer. Beperkings van CT kan lei tot gereelde opvolgondersoeke en vals-positiewe resultate, wat lei tot onnodige intervensie en oorbehandeling6. Daarom is daar 'n behoefte om betroubare en bruikbare biomerkers te ontwikkel om longkanker korrek in die vroeë stadiums te identifiseer en die meeste goedaardige nodules by aanvanklike opsporing te onderskei7.
Omvattende molekulêre analise van bloed (serum, plasma, perifere bloed mononukleêre selle), insluitend genomika, proteomika of DNA-metilering8,9,10, het gelei tot groeiende belangstelling in die ontdekking van diagnostiese biomerkers vir longkanker. Intussen meet metabolomika-benaderings sellulêre eindprodukte wat beïnvloed word deur endogene en eksogene aksies en word dus toegepas om siekte-aanvang en -uitkoms te voorspel. Vloeistofchromatografie-tandem massaspektrometrie (LC-MS) is 'n wyd gebruikte metode vir metabolomika-studies as gevolg van sy hoë sensitiwiteit en groot dinamiese omvang, wat metaboliete met verskillende fisies-chemiese eienskappe11,12,13 kan dek. Alhoewel globale metabolomika-analise van plasma/serum gebruik is om biomerkers te identifiseer wat verband hou met longkankerdiagnose14,15,16,17 en behandelingsdoeltreffendheid,18 moet serummetabolietklassifiseerders om tussen goedaardige en kwaadaardige longnodules te onderskei, nog baie bestudeer word. -massiewe navorsing.
Adenokarsinoom en plaveiselkarsinoom is die twee hoof subtipes van nie-kleinsellige longkanker (NSCLC). Verskeie CT-siftingstoetse dui daarop dat adenokarsinoom die mees algemene histologiese tipe longkanker is1,19,20,21. In hierdie studie het ons ultra-prestasie vloeistofchromatografie-hoë-resolusie massaspektrometrie (UPLC-HRMS) gebruik om metabolomika-analise op 'n totaal van 695 serummonsters uit te voer, insluitend gesonde kontroles, goedaardige pulmonale nodules en CT-gespoorde ≤3 cm. Sifting vir stadium I longadenokarsinoom. Ons het 'n paneel van serummetaboliete geïdentifiseer wat longadenokarsinoom onderskei van goedaardige nodules en gesonde kontroles. Padverrykingsanalise het aan die lig gebring dat abnormale triptofaan- en glukosemetabolisme algemene veranderinge in longadenokarsinoom is in vergelyking met goedaardige nodules en gesonde kontroles. Laastens het ons 'n serummetaboliese klassifiseerder met hoë spesifisiteit en sensitiwiteit vasgestel en gevalideer om te onderskei tussen maligne en benigne pulmonale nodules wat deur LDCT opgespoor word, wat kan help met vroeë differensiële diagnose en risikobepaling.
In die huidige studie is geslags- en ouderdomsgepaarde serummonsters retrospektief versamel van 174 gesonde kontroles, 292 pasiënte met goedaardige pulmonale nodules en 229 pasiënte met stadium I longadenokarsinoom. Demografiese eienskappe van die 695 proefpersone word in Aanvullende Tabel 1 getoon.
Soos getoon in Figuur 1a, is 'n totaal van 480 serummonsters, insluitend 174 gesonde kontroles (HC), 170 benigne nodules (BN), en 136 stadium I longadenokarsinoom (LA) monsters, by die Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum versamel. Ontdekkingskohort vir ongeteikende metaboliese profilering met behulp van ultra-prestasie vloeistofchromatografie-hoë-resolusie massaspektrometrie (UPLC-HRMS). Soos getoon in Aanvullende Figuur 1, is differensiële metaboliete tussen LA en HC, LA en BN geïdentifiseer om 'n klassifikasiemodel te vestig en differensiële padanalise verder te ondersoek. 104 monsters wat deur die Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum versamel is en 111 monsters wat deur twee ander hospitale versamel is, is onderskeidelik aan interne en eksterne validering onderwerp.
a Studiepopulasie in die ontdekkingskohort wat globale serummetabolomika-analise ondergaan het met behulp van ultra-prestasievloeistofchromatografie-hoëresolusiemassaspektrometrie (UPLC-HRMS). b Gedeeltelike minste kwadrate diskriminantanalise (PLS-DA) van die totale metaboloom van 480 serummonsters van die studiekohort, insluitend gesonde kontroles (HC, n = 174), benigne nodules (BN, n = 170), en stadium I longadenokarsinoom (Los Angeles, n = 136). +ESI, positiewe elektrosproei-ionisasiemodus, -ESI, negatiewe elektrosproei-ionisasiemodus. c–e Metaboliete met beduidend verskillende oorvloed in twee gegewe groepe (tweesydige Wilcoxon-getekende rangtoets, vals ontdekkingstempo-aangepaste p-waarde, FDR <0.05) word in rooi (vouverandering > 1.2) en blou (vouverandering < 0.83) op die vulkaangrafika getoon. f Hiërargiese groeperingshittekaart wat beduidende verskille in die aantal geannoteerde metaboliete tussen LA en BN toon. Brondata word in die vorm van brondatalêers verskaf.
Die totale serummetaboloom van 174 HC, 170 BN en 136 LA in die ontdekkingsgroep is met behulp van UPLC-HRMS-analise geanaliseer. Ons toon eers dat kwaliteitsbeheer (QC) monsters dig saamgroepeer in die middel van 'n onbewaakte hoofkomponentanalise (PCA) model, wat die stabiliteit van die huidige studie se prestasie bevestig (Aanvullende Figuur 2).
Soos getoon in die gedeeltelike kleinste kwadrate-diskriminant-analise (PLS-DA) in Figuur 1b, het ons gevind dat daar duidelike verskille was tussen LA en BN, LA en HC in positiewe (+ESI) en negatiewe (−ESI) elektrosproei-ionisasiemodusse. Geen beduidende verskille is egter gevind tussen BN en HC in +ESI- en -ESI-toestande nie.
Ons het 382 differensiële kenmerke tussen LA en HC, 231 differensiële kenmerke tussen LA en BN, en 95 differensiële kenmerke tussen BN en HC (Wilcoxon getekende rangtoets, FDR <0.05 en veelvuldige verandering >1.2 of <0.83) gevind (Figuur .1c-e). Pieke is verder geannoteer (Aanvullende Data 3) teen 'n databasis (mzCloud/HMDB/Chemspider-biblioteek) deur m/z-waarde, retensietyd en fragmentasiemassaspektrumsoektog (besonderhede beskryf in die Metodes-afdeling) 22. Laastens is 33 en 38 geannoteerde metaboliete met beduidende verskille in oorvloed geïdentifiseer vir LA teenoor BN (Figuur 1f en Aanvullende Tabel 2) en LA teenoor HC (Aanvullende Figuur 3 en Aanvullende Tabel 2), onderskeidelik. In teenstelling hiermee is slegs 3 metaboliete met beduidende verskille in oorvloed in BN en HC geïdentifiseer (Aanvullende Tabel 2), wat ooreenstem met die oorvleueling tussen BN en HC in PLS-DA. Hierdie differensiële metaboliete dek 'n wye reeks biochemikalieë (Aanvullende Figuur 4). Saamgevat toon hierdie resultate beduidende veranderinge in die serummetaboloom wat die maligne transformasie van vroeëstadium longkanker weerspieël in vergelyking met goedaardige longnodules of gesonde individue. Intussen dui die ooreenkoms van die serummetaboloom van BN en HC daarop dat goedaardige pulmonale nodules baie biologiese eienskappe met gesonde individue kan deel. Aangesien epidermale groeifaktorreseptor (EGFR) geenmutasies algemeen voorkom in longadenokarsinoom subtipe 23, het ons gepoog om die impak van drywermutasies op die serummetaboloom te bepaal. Ons het toe die algehele metaboliese profiel van 72 gevalle met EGFR-status in die longadenokarsinoomgroep geanaliseer. Interessant genoeg het ons vergelykbare profiele tussen EGFR-mutantpasiënte (n = 41) en EGFR-wildtipepasiënte (n = 31) in PCA-analise gevind (Aanvullende Figuur 5a). Ons het egter 7 metaboliete geïdentifiseer waarvan die oorvloed beduidend verander het in pasiënte met EGFR-mutasie in vergelyking met pasiënte met wildetipe EGFR (t-toets, p < 0.05 en vouverandering > 1.2 of < 0.83) (Aanvullende Figuur 5b). Die meerderheid van hierdie metaboliete (5 uit 7) is asielkarnitiene, wat 'n belangrike rol speel in vetsuuroksidasieweë.
Soos geïllustreer in die werkvloei wat in Figuur 2a getoon word, is biomerkers vir noduleklassifikasie verkry deur gebruik te maak van minste absolute krimpingsoperateurs en seleksie gebaseer op 33 differensiële metaboliete wat in LA (n = 136) en BN (n = 170) geïdentifiseer is. Beste kombinasie van veranderlikes (LASSO) – binêre logistiese regressiemodel. Tienvoudige kruisvalidering is gebruik om die betroubaarheid van die model te toets. Veranderlikeseleksie en parameterregularisering word aangepas deur 'n waarskynlikheidsmaksimeringsstraf met parameter λ24. Globale metabolomika-analise is verder onafhanklik uitgevoer in die interne validerings- (n = 104) en eksterne validerings- (n = 111) groepe om die klassifikasieprestasie van die diskriminantmodel te toets. Gevolglik is 27 metaboliete in die ontdekkingstel geïdentifiseer as die beste diskriminantmodel met die grootste gemiddelde AUC-waarde (Fig. 2b), waaronder 9 verhoogde aktiwiteit en 18 verminderde aktiwiteit in LA in vergelyking met BN gehad het (Fig. 2c).
Werkvloei vir die bou van 'n pulmonale nodusklassifiseerder, insluitend die keuse van die beste paneel van serummetaboliete in die ontdekkingsgroep met behulp van 'n binêre logistiese regressiemodel via tienvoudige kruisvalidering en die evaluering van voorspellende prestasie in interne en eksterne valideringsgroepe. b Kruisvalideringsstatistieke van die LASSO-regressiemodel vir metaboliese biomerkerseleksie. Die bogenoemde getalle verteenwoordig die gemiddelde aantal biomerkers wat by 'n gegewe λ gekies is. Die rooi stippellyn verteenwoordig die gemiddelde AUC-waarde by die ooreenstemmende lambda. Grys foutbalke verteenwoordig die minimum en maksimum AUC-waardes. Die stippellyn dui die beste model met die 27 geselekteerde biomerkers aan. AUC, area onder die ontvanger-bedryfskenmerk (ROC)-kurwe. c Vouveranderinge van 27 geselekteerde metaboliete in die LA-groep in vergelyking met die BN-groep in die ontdekkingsgroep. Rooi kolom – aktivering. Die blou kolom is 'n afname. d–f Ontvanger-bedryfskenmerk (ROC)-kurwes wat die krag van die diskriminantmodel toon gebaseer op 27 metabolietkombinasies in die ontdekkings-, interne en eksterne valideringsgroepe. Brondata word verskaf in die vorm van brondatalêers.
'n Voorspellingsmodel is geskep gebaseer op die geweegde regressiekoëffisiënte van hierdie 27 metaboliete (Aanvullende Tabel 3). ROC-analise gebaseer op hierdie 27 metaboliete het 'n area onder die kurwe (AUC) waarde van 0.933 opgelewer, ontdekkingsgroep sensitiwiteit was 0.868, en spesifisiteit was 0.859 (Fig. 2d). Intussen, onder die 38 geannoteerde differensiële metaboliete tussen LA en HC, het 'n stel van 16 metaboliete 'n AUC van 0.902 bereik met 'n sensitiwiteit van 0.801 en spesifisiteit van 0.856 in die onderskeiding van LA van HC (Aanvullende Figuur 6a-c). AUC-waardes gebaseer op verskillende vouveranderingsdrempels vir differensiële metaboliete is ook vergelyk. Ons het gevind dat die klassifikasiemodel die beste gevaar het in die onderskeiding tussen LA en BN (HC) toe die vouveranderingsvlak op 1.2 teenoor 1.5 of 2.0 gestel is (Aanvullende Figuur 7a,b). Die klassifikasiemodel, gebaseer op 27 metabolietgroepe, is verder gevalideer in interne en eksterne kohorte. Die AUC was 0.915 (sensitiwiteit 0.867, spesifisiteit 0.811) vir interne validering en 0.945 (sensitiwiteit 0.810, spesifisiteit 0.979) vir eksterne validering (Fig. 2e, f). Om interlaboratoriumdoeltreffendheid te bepaal, is 40 monsters van die eksterne kohort in 'n eksterne laboratorium geanaliseer soos beskryf in die Metodes-afdeling. Die klassifikasieakkuraatheid het 'n AUC van 0.925 behaal (Aanvullende Figuur 8). Omdat longplaveiselkarsinoom (LUSC) die tweede mees algemene subtipe van nie-kleinsellige longkanker (NSCLC) na longadenokarsinoom (LUAD) is, het ons ook die gevalideerde potensiële nut van metaboliese profiele getoets. BN en 16 gevalle van LUSC. Die AUC van onderskeiding tussen LUSC en BN was 0.776 (Aanvullende Figuur 9), wat dui op 'n swakker vermoë in vergelyking met onderskeiding tussen LUAD en BN.
Studies het getoon dat die grootte van nodules op CT-beelde positief gekorreleer is met die waarskynlikheid van maligniteit en 'n belangrike bepaler van nodulebehandeling bly25,26,27. Analise van data van die groot kohort van die NELSON-siftingstudie het getoon dat die risiko van maligniteit by proefpersone met nodusse <5 mm selfs soortgelyk was aan dié by proefpersone sonder nodusse28. Daarom is die minimum grootte wat gereelde CT-monitering vereis, 5 mm, soos aanbeveel deur die British Thoracic Society (BTS), en 6 mm, soos aanbeveel deur die Fleischner Society29. Nodules groter as 6 mm en sonder ooglopende goedaardige kenmerke, genaamd onbepaalde pulmonale nodules (IPN), bly egter 'n groot uitdaging in evaluering en bestuur in die kliniese praktyk30,31. Ons het vervolgens ondersoek of nodulegrootte metabolomiese handtekeninge beïnvloed het deur gebruik te maak van saamgevoegde monsters van die ontdekkings- en interne valideringskohorte. Deur te fokus op 27 gevalideerde biomerkers, het ons eers die PCA-profiele van HC- en BN sub-6 mm metabolome vergelyk. Ons het gevind dat die meeste van die datapunte vir HC en BN oorvleuel het, wat toon dat serummetabolietvlakke soortgelyk was in beide groepe (Fig. 3a). Die kenmerkkaarte oor verskillende groottereekse het behoue gebly in BN en LA (Fig. 3b, c), terwyl 'n skeiding waargeneem is tussen maligne en benigne nodules in die 6-20 mm-reeks (Fig. 3d). Hierdie kohort het 'n AUC van 0.927, spesifisiteit van 0.868 en sensitiwiteit van 0.820 gehad vir die voorspelling van die maligniteit van nodules wat 6 tot 20 mm meet (Fig. 3e, f). Ons resultate toon dat die klassifiseerder metaboliese veranderinge wat veroorsaak word deur vroeë maligne transformasie, kan vasvang, ongeag die nodulegrootte.
ad Vergelyking van PCA-profiele tussen gespesifiseerde groepe gebaseer op 'n metaboliese klassifiseerder van 27 metaboliete. CC en BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. in LA 6–20 mm teenoor LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm en LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Ontvanger-bedryfskenmerk (ROC)-kurwe wat die diskriminantmodelprestasie vir nodules 6–20 mm toon. f Waarskynlikheidswaardes is bereken op grond van die logistiese regressiemodel vir nodules wat 6–20 mm meet. Die grys stippellyn verteenwoordig die optimale afsnywaarde (0.455). Die bostaande syfers verteenwoordig die persentasie gevalle wat vir Los Angeles geprojekteer word. Gebruik 'n tweesydige Student se t-toets. PCA, hoofkomponentanalise. AUC-area onder die kurwe. Brondata word verskaf in die vorm van brondatalêers.
Vier monsters (ouderdomme 44–61 jaar) met soortgelyke pulmonale nodulegroottes (7–9 mm) is verder gekies om die werkverrigting van die voorgestelde maligniteitvoorspellingsmodel te illustreer (Fig. 4a, b). Tydens aanvanklike sifting het Geval 1 as 'n soliede nodule met verkalking voorgekom, 'n kenmerk wat met goedaardigheid geassosieer word, terwyl Geval 2 as 'n onbepaalde gedeeltelik soliede nodule met geen ooglopende goedaardige kenmerke voorgekom het nie. Drie rondes opvolg-CT-skanderings het getoon dat hierdie gevalle oor 'n tydperk van 4 jaar stabiel gebly het en dus as goedaardige nodules beskou is (Fig. 4a). In vergelyking met kliniese evaluering van reeks-CT-skanderings, het enkel-skoot serummetabolietanalise met die huidige klassifiseerdermodel hierdie goedaardige nodules vinnig en korrek geïdentifiseer op grond van probabilistiese beperkings (Tabel 1). Figuur 4b in geval 3 toon 'n nodule met tekens van pleurale terugtrekking, wat meestal met maligniteit geassosieer word32. Geval 4 het as 'n onbepaalde gedeeltelik soliede nodule voorgekom sonder bewyse van 'n goedaardige oorsaak. Al hierdie gevalle is volgens die klassifiseerdermodel as maligne voorspel (Tabel 1). Die assessering van longadenokarsinoom is gedemonstreer deur histopatologiese ondersoek na longreseksie-chirurgie (Fig. 4b). Vir die eksterne valideringsstel het die metaboliese klassifiseerder twee gevalle van onbepaalde longnodules groter as 6 mm akkuraat voorspel (Aanvullende Figuur 10).
CT-beelde van die aksiale venster van die longe van twee gevalle van goedaardige nodules. In geval 1 het 'n CT-skandering na 4 jaar 'n stabiele soliede nodule van 7 mm met verkalking in die regter onderlob getoon. In geval 2 het 'n CT-skandering na 5 jaar 'n stabiele, gedeeltelik soliede nodule met 'n deursnee van 7 mm in die regter boonste lob getoon. b Aksiale venster CT-beelde van die longe en ooreenstemmende patologiese studies van twee gevalle van stadium I adenokarsinoom voor longreseksie getoon. Geval 3 het 'n nodule met 'n deursnee van 8 mm in die regter boonste lob met pleurale terugtrekking getoon. Geval 4 het 'n gedeeltelik soliede matglasnodule van 9 mm in die linker boonste lob getoon. Hematoksilien- en eosine (H&E) kleuring van geresekeerde longweefsel (skaalbalk = 50 μm) wat die asinêre groeipatroon van longadenokarsinoom demonstreer. Pyle dui nodules aan wat op CT-beelde opgespoor is. H&E-beelde is verteenwoordigende beelde van veelvuldige (>3) mikroskopiese velde wat deur die patoloog ondersoek is.
Saamgevat demonstreer ons resultate die potensiële waarde van serummetaboliet-biomerkers in die differensiële diagnose van pulmonale nodules, wat uitdagings kan inhou wanneer CT-sifting geëvalueer word.
Gebaseer op 'n gevalideerde differensiële metabolietpaneel, het ons gepoog om biologiese korrelate van groot metaboliese veranderinge te identifiseer. KEGG-roeteverrykingsanalise deur MetaboAnalyst het 6 algemene beduidend veranderde roetes tussen die twee gegewe groepe geïdentifiseer (LA vs. HC en LA vs. BN, aangepaste p ≤ 0.001, effek > 0.01). Hierdie veranderinge is gekenmerk deur steurnisse in piruvaatmetabolisme, triptofaanmetabolisme, niasien- en nikotienamiedmetabolisme, glikolise, die TCA-siklus en purienmetabolisme (Fig. 5a). Ons het toe verder geteikende metabolomika uitgevoer om groot veranderinge te verifieer deur absolute kwantifisering te gebruik. Bepaling van algemene metaboliete in algemeen veranderde roetes deur drievoudige kwadrupoolmassaspektrometrie (QQQ) met behulp van outentieke metabolietstandaarde. Demografiese eienskappe van die teikenmonster van die metabolomika-studie word ingesluit in Aanvullende Tabel 4. In ooreenstemming met ons globale metabolomika-resultate, het kwantitatiewe analise bevestig dat hipoksantien en xantien, piruvaat en laktaat verhoog was in LA in vergelyking met BN en HC (Fig. 5b, c, p <0.05). Geen beduidende verskille in hierdie metaboliete is egter tussen BN en HC gevind nie.
KEGG-roeteverrykingsanalise van beduidend verskillende metaboliete in die LA-groep in vergelyking met die BN- en HC-groepe. 'n Tweesydige Globaltoets is gebruik, en p-waardes is aangepas met behulp van die Holm-Bonferroni-metode (aangepaste p ≤ 0.001 en effekgrootte > 0.01). b–d Vioolgrafieke wat hipoksantien-, xantien-, laktaat-, piruvaat- en triptofaanvlakke in serum HC, BN en LA toon, bepaal deur LC-MS/MS (n = 70 per groep). Wit en swart stippellyne dui onderskeidelik die mediaan en kwartiel aan. e Vioolgrafiek wat genormaliseerde Log2TPM (transkripsies per miljoen) mRNA-uitdrukking van SLC7A5 en QPRT in longadenokarsinoom (n = 513) toon in vergelyking met normale longweefsel (n = 59) in die LUAD-TCGA-datastel. Die wit blokkie verteenwoordig die interkwartielreeks, die horisontale swart lyn in die middel verteenwoordig die mediaan, en die vertikale swart lyn wat vanaf die blokkie strek, verteenwoordig die 95%-vertrouensinterval (VI). f Pearson-korrelasiegrafiek van SLC7A5- en GAPDH-uitdrukking in longadenokarsinoom (n = 513) en normale longweefsel (n = 59) in die TCGA-datastel. Die grys area verteenwoordig die 95%-VI. r, Pearson-korrelasiekoëffisiënt. g Genormaliseerde sellulêre triptofaanvlakke in A549-selle getransfekteer met niespesifieke shRNA-beheer (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bepaal deur LC-MS/MS. Statistiese analise van vyf biologies onafhanklike monsters in elke groep word aangebied. h Sellulêre vlakke van NADt (totale NAD, insluitend NAD+ en NADH) in A549-selle (NC) en SLC7A5-onderdrukte A549-selle (Sh1, Sh2). Statistiese analise van drie biologies onafhanklike monsters in elke groep word aangebied. i Glikolitiese aktiwiteit van A549-selle voor en na SLC7A5-onderdrukking is gemeet deur ekstrasellulêre versuringstempo (ECAR) (n = 4 biologies onafhanklike monsters per groep). 2-DG,2-deoksi-D-glukose. Tweesydige Student se t-toets is in (b-h) gebruik. In (g-i) verteenwoordig foutbalke die gemiddelde ± SD, elke eksperiment is drie keer onafhanklik uitgevoer en die resultate was soortgelyk. Brondata word in die vorm van brondatalêers verskaf.
In die lig van die beduidende impak van veranderde triptofaanmetabolisme in die LA-groep, het ons ook serumtriptofaanvlakke in die HC-, BN- en LA-groepe met behulp van QQQ geassesseer. Ons het gevind dat serumtriptofaan in LA verminder was in vergelyking met HC of BN (p < 0.001, Figuur 5d), wat ooreenstem met vorige bevindinge dat sirkulerende triptofaanvlakke laer is by pasiënte met longkanker as in gesonde kontroles van die kontrolegroep33,34,35. 'n Ander studie met behulp van die PET/CT-spoorder 11C-metiel-L-triptofaan het bevind dat die triptofaanseinretensietyd in longkankerweefsel beduidend verhoog is in vergelyking met goedaardige letsels of normale weefsel36. Ons hipotetiseer dat die afname in triptofaan in LA-serum aktiewe triptofaanopname deur longkankerselle kan weerspieël.
Dit is ook bekend dat die eindproduk van die kynurenien-roete van triptofaankatabolisme NAD+37,38 is, wat 'n belangrike substraat is vir die reaksie van gliseraldehied-3-fosfaat met 1,3-bisfosfogliseraat in glikolise39. Terwyl vorige studies gefokus het op die rol van triptofaankatabolisme in immuunregulering, het ons gepoog om die wisselwerking tussen triptofaan-disregulering en glikolitiese weë wat in die huidige studie waargeneem is, te verduidelik. Opgeloste stoftransporterfamilie 7 lid 5 (SLC7A5) is bekend as 'n triptofaantransporter43,44,45. Kinoliensuurfosforibosieltransferase (QPRT) is 'n ensiem wat stroomaf van die kynurenien-roete geleë is wat kinoliensuur na NAMN46 omskakel. Inspeksie van die LUAD TCGA-datastel het aan die lig gebring dat beide SLC7A5 en QPRT beduidend opgereguleer was in tumorweefsel in vergelyking met normale weefsel (Fig. 5e). Hierdie toename is waargeneem in stadiums I en II sowel as stadiums III en IV van longadenokarsinoom (Aanvullende Figuur 11), wat dui op vroeë steurnisse in triptofaanmetabolisme wat met tumorigenese geassosieer word.
Daarbenewens het die LUAD-TCGA-datastel 'n positiewe korrelasie tussen SLC7A5 en GAPDH mRNA-uitdrukking in kankerpasiëntmonsters getoon (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figuur 5f). In teenstelling hiermee is geen beduidende korrelasie gevind tussen sulke geenhandtekeninge in normale longweefsel nie (r = 0.25, p = 0.06, Figuur 5f). Die onderdrukking van SLC7A5 (Aanvullende Figuur 12) in A549-selle het sellulêre triptofaan- en NAD(H)-vlakke aansienlik verminder (Figuur 5g,h), wat gelei het tot verswakte glikolitiese aktiwiteit soos gemeet deur ekstrasellulêre versuringstempo (ECAR) (Figuur 1). 5i). Dus, gebaseer op metaboliese veranderinge in serum en in vitro-deteksie, veronderstel ons dat triptofaanmetabolisme NAD+ deur die kynurenienroete kan produseer en 'n belangrike rol kan speel in die bevordering van glikolise in longkanker.
Studies het getoon dat 'n groot aantal onbepaalde pulmonale nodules wat deur LDCT opgespoor word, kan lei tot die behoefte aan addisionele toetse soos PET-CT, longbiopsie en oorbehandeling as gevolg van 'n vals-positiewe diagnose van maligniteit.31 Soos getoon in Figuur 6, het ons studie 'n paneel van serummetaboliete met potensiële diagnostiese waarde geïdentifiseer wat risikostratifikasie en daaropvolgende bestuur van pulmonale nodules wat deur CT opgespoor word, kan verbeter.
Pulmonale nodules word geëvalueer deur middel van lae-dosis rekenaartomografie (LDCT) met beeldkenmerke wat dui op goedaardige of kwaadaardige oorsake. Die onsekere uitkoms van nodules kan lei tot gereelde opvolgbesoeke, onnodige intervensies en oorbehandeling. Die insluiting van serummetaboliese klassifiseerders met diagnostiese waarde kan risikobepaling en daaropvolgende bestuur van pulmonale nodules verbeter. PET-positronemissietomografie.
Data van die Amerikaanse NLST-studie en die Europese NELSON-studie dui daarop dat die sifting van hoërisikogroepe met lae-dosis rekenaartomografie (LDCT) longkankersterftes kan verminder1,3. Risikobepaling en daaropvolgende kliniese bestuur van groot getalle toevallige pulmonale nodules wat deur LDCT opgespoor word, bly egter die mees uitdagende. Die hoofdoel is om die korrekte klassifikasie van bestaande LDCT-gebaseerde protokolle te optimaliseer deur betroubare biomerkers in te sluit.
Sekere molekulêre biomerkers, soos bloedmetaboliete, is geïdentifiseer deur longkanker met gesonde kontroles te vergelyk15,17. In die huidige studie het ons gefokus op die toepassing van serummetabolomika-analise om te onderskei tussen goedaardige en kwaadaardige pulmonale nodules wat toevallig deur LDCT opgespoor is. Ons het die globale serummetaboloom van gesonde kontrole (HC), goedaardige longnodules (BN) en stadium I longadenokarsinoom (LA) monsters vergelyk met behulp van UPLC-HRMS-analise. Ons het gevind dat HC en BN soortgelyke metaboliese profiele gehad het, terwyl LA beduidende veranderinge getoon het in vergelyking met HC en BN. Ons het twee stelle serummetaboliete geïdentifiseer wat LA van HC en BN onderskei.
Die huidige LDCT-gebaseerde identifikasieskema vir goedaardige en kwaadaardige nodules is hoofsaaklik gebaseer op die grootte, digtheid, morfologie en groeikoers van nodules oor tyd30. Vorige studies het getoon dat die grootte van nodules nou verwant is aan die waarskynlikheid van longkanker. Selfs by hoërisiko-pasiënte is die risiko van maligniteit in nodules <6 mm <1%. Die risiko van maligniteit vir nodules wat 6 tot 20 mm meet, wissel van 8% tot 64%30. Daarom beveel die Fleischner-vereniging 'n afsnydiameter van 6 mm aan vir roetine-CT-opvolg.29 Risikobepaling en bestuur van onbepaalde pulmonale nodules (IPN) groter as 6 mm is egter nie voldoende uitgevoer nie31. Huidige bestuur van aangebore hartsiektes is gewoonlik gebaseer op waaksame wag met gereelde CT-monitering.
Gebaseer op die gevalideerde metaboloom, het ons vir die eerste keer die oorvleueling van metabolomiese handtekeninge tussen gesonde individue en goedaardige nodules <6 mm gedemonstreer. Die biologiese ooreenkoms stem ooreen met vorige CT-bevindinge dat die risiko van maligniteit vir nodules <6 mm so laag is soos vir proefpersone sonder nodules.30 Daar moet kennis geneem word dat ons resultate ook toon dat goedaardige nodules <6 mm en ≥6 mm hoë ooreenkoms in metabolomiese profiele het, wat daarop dui dat die funksionele definisie van goedaardige etiologie konsekwent is ongeag die nodulegrootte. Dus kan moderne diagnostiese serummetabolietpanele 'n enkele toets as 'n uitsluittoets verskaf wanneer nodules aanvanklik op CT opgespoor word en moontlik seriële monitering verminder. Terselfdertyd het dieselfde paneel van metaboliese biomerkers kwaadaardige nodules ≥6 mm in grootte onderskei van goedaardige nodules en akkurate voorspellings vir IPN's van soortgelyke grootte en dubbelsinnige morfologiese kenmerke op CT-beelde verskaf. Hierdie serummetabolismeklassifiseerder het goed gevaar in die voorspelling van die maligniteit van nodules ≥6 mm met 'n AUC van 0.927. Saamgevat dui ons resultate daarop dat unieke serummetabolomiese handtekeninge spesifiek vroeë tumor-geïnduseerde metaboliese veranderinge kan weerspieël en potensiële waarde as risikovoorspellers het, onafhanklik van nodulegrootte.
Dit is opmerklik dat longadenokarsinoom (LUAD) en plaveiselkarsinoom (LUSC) die hooftipes nie-kleinsellige longkanker (NSCLC) is. Aangesien LUSC sterk geassosieer word met tabakgebruik47 en LUAD die mees algemene histologie van toevallige longnodules is wat tydens CT-sifting opgespoor word48, is ons klassifiseerdermodel spesifiek gebou vir stadium I-adenokarsinoommonsters. Wang en kollegas het ook op LUAD gefokus en nege lipiedhandtekeninge geïdentifiseer deur lipidomika te gebruik om vroeëstadium-longkanker van gesonde individue te onderskei17. Ons het die huidige klassifiseerdermodel op 16 gevalle van stadium I LUSC en 74 goedaardige nodules getoets en lae LUSC-voorspellingsakkuraatheid (AUC 0.776) waargeneem, wat daarop dui dat LUAD en LUSC hul eie metabolomiese handtekeninge kan hê. Inderdaad, LUAD en LUSC verskil in etiologie, biologiese oorsprong en genetiese afwykings49. Daarom moet ander tipes histologie ingesluit word in opleidingsmodelle vir bevolkingsgebaseerde opsporing van longkanker in siftingsprogramme.
Hier het ons die ses mees gereeld veranderde bane in longadenokarsinoom geïdentifiseer in vergelyking met gesonde kontroles en benigne nodules. Xanthien en hipoksantien is algemene metaboliete van die purienmetabolismebaan. In ooreenstemming met ons resultate, was tussenprodukte wat met purienmetabolisme geassosieer word, beduidend verhoog in die serum of weefsels van pasiënte met longadenokarsinoom in vergelyking met gesonde kontroles of pasiënte in die pre-invasieve stadium15,50. Verhoogde serumxanthien- en hipoksantienvlakke kan die anabolisme weerspieël wat benodig word deur vinnig prolifererende kankerselle. Disregulering van glukosemetabolisme is 'n bekende kenmerk van kankermetabolisme51. Hier het ons 'n beduidende toename in piruvaat en laktaat in die LA-groep waargeneem in vergelyking met die HC- en BN-groep, wat ooreenstem met vorige verslae van glikolitiese baanafwykings in die serummetaboloomprofiele van nie-kleinsellige longkanker (NSCLC)-pasiënte en gesonde kontroles. Die resultate is konsekwent52,53.
Dit is belangrik dat ons 'n omgekeerde korrelasie tussen piruvaat- en triptofaanmetabolisme in die serum van longadenokarsinome waargeneem het. Serumtriptofaanvlakke was verminder in die LA-groep in vergelyking met die HC- of BN-groep. Interessant genoeg het 'n vorige grootskaalse studie met 'n prospektiewe kohort bevind dat lae vlakke van sirkulerende triptofaan geassosieer word met 'n verhoogde risiko van longkanker 54. Triptofaan is 'n essensiële aminosuur wat ons geheel en al uit voedsel kry. Ons kom tot die gevolgtrekking dat serumtriptofaanuitputting in longadenokarsinoom die vinnige uitputting van hierdie metaboliet kan weerspieël. Dit is welbekend dat die eindproduk van triptofaankatabolisme via die kynurenienroete die bron van de novo NAD+-sintese is. Omdat NAD+ hoofsaaklik deur die bergingsroete geproduseer word, moet die belangrikheid van NAD+ in triptofaanmetabolisme in gesondheid en siekte nog bepaal word 46. Ons analise van die TCGA-databasis het getoon dat die uitdrukking van die triptofaan-transporter opgeloste stof-transporter 7A5 (SLC7A5) beduidend verhoog was in longadenokarsinoom in vergelyking met normale kontroles en positief gekorreleer was met die uitdrukking van die glikolitiese ensiem GAPDH. Vorige studies het hoofsaaklik gefokus op die rol van triptofaankatabolisme in die onderdrukking van die antitumor-immuunrespons40,41,42. Hier demonstreer ons dat inhibisie van triptofaanopname deur die afskakeling van SLC7A5 in longkankerselle lei tot 'n daaropvolgende afname in sellulêre NAD-vlakke en 'n gepaardgaande verswakking van glikolitiese aktiwiteit. Samevattend bied ons studie 'n biologiese basis vir veranderinge in serummetabolisme wat verband hou met maligne transformasie van longadenokarsinoom.
EGFR-mutasies is die mees algemene drywermutasies in pasiënte met NSCLC. In ons studie het ons gevind dat pasiënte met EGFR-mutasie (n = 41) algehele metabolomiese profiele soortgelyk aan pasiënte met wilde-tipe EGFR (n = 31) gehad het, hoewel ons verlaagde serumvlakke van sommige EGFR-mutantpasiënte in asielkarnitienpasiënte gevind het. Die gevestigde funksie van asielkarnitiene is om asielgroepe van die sitoplasma na die mitochondriale matriks te vervoer, wat lei tot die oksidasie van vetsure om energie te produseer 55. In ooreenstemming met ons bevindinge, het 'n onlangse studie ook soortgelyke metaboloomprofiele tussen EGFR-mutant en EGFR-wildtipe gewasse geïdentifiseer deur die globale metaboloom van 102 longadenokarsinoomweefselmonsters50 te analiseer. Interessant genoeg is asielkarnitieninhoud ook in die EGFR-mutantgroep gevind. Daarom, of veranderinge in asielkarnitienvlakke EGFR-geïnduseerde metaboliese veranderinge en die onderliggende molekulêre weë weerspieël, mag verdere studie verdien.
Ten slotte stel ons studie 'n serummetaboliese klassifiseerder vir die differensiële diagnose van pulmonale nodules vas en stel 'n werkvloei voor wat risikobepaling kan optimaliseer en kliniese bestuur gebaseer op CT-skandering kan fasiliteer.
Hierdie studie is goedgekeur deur die Etiekkomitee van die Sun Yat-sen Universiteit Kankerhospitaal, die Eerste Geaffilieerde Hospitaal van die Sun Yat-sen Universiteit, en die Etiekkomitee van die Zhengzhou Universiteit Kankerhospitaal. In die ontdekkings- en interne valideringsgroepe is 174 sera van gesonde individue en 244 sera van benigne nodules versamel van individue wat jaarlikse mediese ondersoeke ondergaan het by die Departement van Kankerbeheer en -voorkoming, die Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum, en 166 benigne nodules serum. Stadium I longadenokarsinome is versamel van die Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum. In die eksterne valideringskohort was daar 48 gevalle van benigne nodules, 39 gevalle van stadium I longadenokarsinoom van die Eerste Geaffilieerde Hospitaal van die Sun Yat-sen Universiteit, en 24 gevalle van stadium I longadenokarsinoom van die Zhengzhou Kankerhospitaal. Die Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum het ook 16 gevalle van stadium I plaveisellongkanker versamel om die diagnostiese vermoë van die gevestigde metaboliese klassifiseerder te toets (pasiëntkenmerke word in Aanvullende Tabel 5 getoon). Monsters van die ontdekkingskohort en interne valideringskohort is tussen Januarie 2018 en Mei 2020 versamel. Monsters vir die eksterne valideringskohort is tussen Augustus 2021 en Oktober 2022 versamel. Om geslagsvooroordeel te verminder, is ongeveer gelyke getalle manlike en vroulike gevalle aan elke kohort toegeken. Ontdekkingspan en Interne Hersieningspan. Deelnemersgeslag is bepaal op grond van selfverslag. Ingeligte toestemming is van alle deelnemers verkry en geen vergoeding is verskaf nie. Proefpersone met goedaardige nodules was dié met 'n stabiele CT-skanderingtelling op 2 tot 5 jaar ten tyde van analise, behalwe vir 1 geval van die eksterne valideringmonster, wat preoperatief versamel en deur histopatologie gediagnoseer is. Met die uitsondering van chroniese brongitis. Longadenokarsinoomgevalle is voor longreseksie versamel en deur patologiese diagnose bevestig. Vastende bloedmonsters is in serumskeidingsbuise versamel sonder enige antikoagulante. Bloedmonsters is vir 1 uur by kamertemperatuur gestol en dan vir 10 minute by 4°C by 2851 × g gesentrifugeer om serumsupernatant te versamel. Serum-aliquots is by -80°C gevries tot metaboliet-ekstraksie. Die Departement van Kankervoorkoming en Mediese Ondersoek van die Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum het 'n poel serum van 100 gesonde skenkers versamel, insluitend 'n gelyke aantal mans en vroue tussen 40 en 55 jaar oud. Gelyke volumes van elke skenkermonster is gemeng, die gevolglike poel is alikwoteer en by -80°C gestoor. Die serummengsel is as verwysingsmateriaal vir kwaliteitsbeheer en datastandaardisering gebruik.
Verwysingserum en toetsmonsters is ontdooi en metaboliete is geëkstraheer met behulp van 'n gekombineerde ekstraksiemetode (MTBE/metanol/water) 56. Kortliks, 50 μl serum is gemeng met 225 μl yskoue metanol en 750 μl yskoue metiel-tert-butieleter (MTBE). Roer die mengsel en inkubeer dit vir 1 uur op ys. Die monsters is toe gemeng en gevortex met 188 μl MS-graad water wat interne standaarde bevat (13C-laktaat, 13C3-piruvaat, 13C-metionien en 13C6-isoleusien, aangekoop van Cambridge Isotope Laboratories). Die mengsel is toe gesentrifugeer teen 15 000 × g vir 10 minute by 4 °C, en die onderste fase is oorgedra na twee buise (125 μL elk) vir LC-MS-analise in positiewe en negatiewe modusse. Laastens is die monster tot droogheid verdamp in 'n hoëspoed-vakuumkonsentrator.
Die gedroogde metaboliete is gerekonstitueer in 120 μl 80% asetonitriel, vir 5 min gevortex en vir 10 min by 4°C gesentrifugeer teen 15 000 × g. Supernatante is oorgedra na amberkleurige glasflessies met mikro-insetsels vir metabolomika-studies. Ongeteikende metabolomika-analise op 'n ultra-prestasie vloeistofchromatografie-hoë-resolusie massaspektrometrie (UPLC-HRMS) platform. Metaboliete is geskei met behulp van 'n Dionex Ultimate 3000 UPLC-stelsel en 'n ACQUITY BEH Amiedkolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). In positiewe ioonmodus was die mobiele fases 95% (A) en 50% asetonitriel (B), elk met 10 mmol/L ammoniumasetaat en 0.1% mieresuur. In negatiewe modus het mobiele fases A en B onderskeidelik 95% en 50% asetonitriel bevat, beide fases het 10 mmol/L ammoniumasetaat bevat, pH = 9. Die gradiëntprogram was soos volg: 0–0.5 min, 2% B; 0.5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16.1 min, 98–2% B; 16.1–20 min, 2% B. Die kolom is by 40°C gehou en die monster by 10°C in die outomatiseerder. Die vloeitempo was 0.3 ml/min, die inspuitvolume was 3 μl. 'n Q-Exactive Orbitrap massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) met 'n elektrosproei-ionisasie (ESI) bron is in volle skanderingsmodus bedryf en gekoppel aan die ddMS2 moniteringsmodus om groot volumes data in te samel. Die MS parameters is soos volg ingestel: spuitspanning +3.8 kV/- 3.2 kV, kapillêre temperatuur 320°C, beskermingsgas 40 arb, hulpgas 10 arb, sondeverwarmertemperatuur 350°C, skanderingsbereik 70–1050 m/h, resolusie 70 000. Data is verkry met behulp van Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Om datakwaliteit te bepaal, is saamgevoegde kwaliteitskontrole (KK) monsters gegenereer deur 10 μL aliquots van die supernatant uit elke monster te verwyder. Ses kwaliteitskontrole monster inspuitings is aan die begin van die analitiese volgorde geanaliseer om die stabiliteit van die UPLC-MS-stelsel te bepaal. Kwaliteitskontrole monsters word dan periodiek in die bondel ingebring. Al 11 bondels serummonsters in hierdie studie is deur LC-MS geanaliseer. Aliquots van 'n serumpoelmengsel van 100 gesonde skenkers is as verwysingsmateriaal in onderskeie bondels gebruik om die ekstraksieproses te monitor en aan te pas vir bondel-tot-bondel effekte. Ongeteikende metabolomika-analise van die ontdekkingskohort, interne valideringskohort en eksterne valideringskohort is by die Metabolomika Sentrum van die Sun Yat-sen Universiteit uitgevoer. Die eksterne laboratorium van die Guangdong Universiteit van Tegnologie Analise en Toetssentrum het ook 40 monsters van die eksterne kohort geanaliseer om die werkverrigting van die klassifiseerdermodel te toets.
Na ekstraksie en rekonstitusie is absolute kwantifisering van serummetaboliete gemeet met behulp van ultra-hoëprestasievloeistofchromatografie-tandemmassaspektrometrie (Agilent 6495 drievoudige kwadrupool) met 'n elektrosproei-ionisasie (ESI) bron in veelvuldige reaksiemonitering (MRM) modus. 'n ACQUITY BEH Amiedkolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) is gebruik om metaboliete te skei. Die mobiele fase het bestaan uit 90% (A) en 5% asetonitriel (B) met 10 mmol/L ammoniumasetaat en 0.1% ammoniakoplossing. Die gradiëntprogram was soos volg: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0%B. Die kolom is by 40 °C en die monster by 10 °C in die outomatiseerder gehou. Die vloeitempo was 0.3 mL/min en die inspuitvolume was 1 μL. MS-parameters is soos volg ingestel: kapillêre spanning ±3.5 kV, vernevelaardruk 35 psi, skedegasvloei 12 L/min, skedegastemperatuur 350 °C, drooggastemperatuur 250 °C en drooggasvloei 14 l/min. Die MRM-omskakelings van triptofaan, piruvaat, laktaat, hipoksantien en xantien was onderskeidelik 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 en 151.0–107.9. Data is ingesamel met behulp van Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Vir serummonsters is triptofaan, piruvaat, laktaat, hipoksantien en xantien gekwantifiseer met behulp van kalibrasiekurwes van standaardmengseloplossings. Vir selmonsters is die triptofaaninhoud genormaliseer tot die interne standaard en selproteïenmassa.
Piekekstraksie (m/z en retensietyd (RT)) is uitgevoer met behulp van Compound Discovery 3.1 en TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Om potensiële verskille tussen bondels uit te skakel, is elke kenmerkende piek van die toetsmonster gedeel deur die kenmerkende piek van die verwysingsmateriaal van dieselfde bondel om die relatiewe oorvloed te verkry. Die relatiewe standaardafwykings van interne standaarde voor en na standaardisering word in Aanvullende Tabel 6 getoon. Verskille tussen die twee groepe is gekenmerk deur vals ontdekkingskoers (FDR<0.05, Wilcoxon getekende rangtoets) en vouverandering (>1.2 of <0.83). Rou MS-data van die geëkstraheerde kenmerke en verwysingserum-gekorrigeerde MS-data word onderskeidelik in Aanvullende Data 1 en Aanvullende Data 2 getoon. Piekannotasie is uitgevoer op grond van vier gedefinieerde vlakke van identifikasie, insluitend geïdentifiseerde metaboliete, vermeend geannoteerde verbindings, vermeend gekarakteriseerde verbindingklasse en onbekende verbindings 22. Gebaseer op databasissoektogte in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), is biologiese verbindings met MS/MS-ooreenstemmende gevalideerde standaarde of presiese ooreenstemmende annotasies in mzCloud (telling > 85) of Chemspider uiteindelik as tussengangers tussen die differensiële metaboloom gekies. Piekannotasies vir elke kenmerk is ingesluit in Aanvullende Data 3. MetaboAnalyst 5.0 is gebruik vir univariate analise van som-genormaliseerde metaboliet-oorvloed. MetaboAnalyst 5.0 het ook KEGG-padverrykingsanalise geëvalueer gebaseer op beduidend verskillende metaboliete. Hoofkomponentanalise (PCA) en gedeeltelike kleinste kwadrate-diskriminantanalise (PLS-DA) is geanaliseer met behulp van die ropls-sagtewarepakket (v.1.26.4) met stapelnormalisering en outoskaling. Die optimale metabolietbiomerkermodel vir die voorspelling van nodule-maligniteit is gegenereer deur gebruik te maak van binêre logistiese regressie met minste absolute krimping en seleksie-operateur (LASSO, R-pakket v.4.1-3). Die werkverrigting van die diskriminantmodel in die opsporings- en valideringsstelle is gekarakteriseer deur die AUC te beraam gebaseer op ROC-analise volgens die pROC-pakket (v.1.18.0.). Die optimale waarskynlikheidsafsnyding is verkry gebaseer op die maksimum Youden-indeks van die model (sensitiwiteit + spesifisiteit – 1). Monsters met waardes kleiner of groter as die drempelwaarde sal voorspel word as goedaardige nodules en longadenokarsinoom, onderskeidelik.
A549-selle (#CCL-185, American Type Culture Collection) is gekweek in F-12K-medium wat 10% FBS bevat. Kort haarspeld-RNA (shRNA)-reekse wat SLC7A5 teiken en 'n nie-teikenkontrole (NC) is in die lentivirale vektor pLKO.1-puro ingevoeg. Die antisense-reekse van shSLC7A5 is soos volg: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Teenliggaampies teen SLC7A5 (#5347) en tubulien (#2148) is van Cell Signaling Technology aangekoop. Teenliggaampies teen SLC7A5 en tubulien is teen 'n verdunning van 1:1000 vir Western blot-analise gebruik.
Die Seahorse XF Glikolitiese Strestoets meet ekstrasellulêre versuringsvlakke (ECAR). In die toets is glukose, oligomisien A en 2-DG opeenvolgend toegedien om sellulêre glikolitiese kapasiteit te toets soos gemeet deur ECAR.
A549-selle getransfekteer met nie-teikenbeheer (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) is oornag in 10 cm deursnee-bakkies geplaas. Selmetaboliete is geëkstraheer met 1 ml yskoue 80% waterige metanol. Selle in die metanoloplossing is afgeskraap, in 'n nuwe buis versamel en vir 15 minute by 4°C by 15 000 × g gesentrifugeer. Versamel 800 µl supernatant en droog met behulp van 'n hoëspoed-vakuumkonsentrator. Die gedroogde metabolietpellets is toe vir triptofaanvlakke geanaliseer met behulp van LC-MS/MS soos hierbo beskryf. Sellulêre NAD(H)-vlakke in A549-selle (NC en shSLC7A5) is gemeet met behulp van 'n kwantitatiewe NAD+/NADH kolorimetriese stel (#K337, BioVision) volgens die vervaardiger se instruksies. Proteïenvlakke is vir elke monster gemeet om die hoeveelheid metaboliete te normaliseer.
Geen statistiese metodes is gebruik om die steekproefgrootte voorlopig te bepaal nie. Vorige metabolomika-studies wat gemik was op die ontdekking van biomerkers15,18 is as maatstawwe vir groottebepaling beskou, en in vergelyking met hierdie verslae was ons steekproef voldoende. Geen monsters is van die studiekohort uitgesluit nie. Serummonsters is ewekansig toegewys aan 'n ontdekkingsgroep (306 gevalle, 74,6%) en 'n interne valideringsgroep (104 gevalle, 25,4%) vir ongeteikende metabolomika-studies. Ons het ook ewekansig 70 gevalle uit elke groep gekies uit die ontdekkingstel vir geteikende metabolomika-studies. Die ondersoekers was blind vir groeptoewysing tydens LC-MS-data-insameling en -analise. Statistiese ontledings van metabolomika-data en sel-eksperimente word beskryf in die onderskeie Resultate, Figuurlegendes en Metodes-afdelings. Kwantifisering van sellulêre triptofaan, NADT en glikolitiese aktiwiteit is drie keer onafhanklik uitgevoer met identiese resultate.
Vir meer inligting oor die studie-ontwerp, sien die Natuurlike Portefeuljeverslag-opsomming wat met hierdie artikel geassosieer word.
Die rou MS-data van die geëkstraheerde kenmerke en die genormaliseerde MS-data van die verwysingserum word onderskeidelik in Aanvullende Data 1 en Aanvullende Data 2 getoon. Piekaantekeninge vir differensiële kenmerke word in Aanvullende Data 3 aangebied. Die LUAD TCGA-datastel kan afgelaai word vanaf https://portal.gdc.cancer.gov/. Die invoerdata vir die plot van die grafiek word in die brondata verskaf. Brondata word vir hierdie artikel verskaf.
Nasionale Longsiftingstudiegroep, ens. Vermindering van longkankersterftes met lae-dosis rekenaartomografie. Noord-Engeland. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR en Prophet, PC Longkankersifting met behulp van lae-dosis heliese CT: resultate van die Nasionale Longsiftingstudie (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Vermindering van longkankersterftes met volumetriese CT-sifting in 'n gerandomiseerde proef. Noord-Engeland. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Plasingstyd: 18 September 2023