Differensiële diagnose van pulmonale nodules wat deur rekenaartomografie (CT) geïdentifiseer word, bly 'n uitdaging in kliniese praktyk.Hier karakteriseer ons die globale metaboloom van 480 serummonsters, insluitend gesonde kontroles, goedaardige longnodules en stadium I long-adenokarsinoom.Adenokarsinome vertoon unieke metabolomiese profiele, terwyl benigne nodules en gesonde individue hoë ooreenkomste in metabolomiese profiele het.In die ontdekkingsgroep (n = 306), is 'n stel van 27 metaboliete geïdentifiseer om te onderskei tussen benigne en kwaadaardige nodules.Die AUC van die diskriminantmodel in die interne validerings- (n = 104) en eksterne validerings- (n = 111) groepe was onderskeidelik 0.915 en 0.945.Weg-analise het verhoogde glikolitiese metaboliete geassosieer met verminderde triptofaan in long-adenokarsinoomserum in vergelyking met goedaardige nodules en gesonde kontroles aan die lig gebring, en het voorgestel dat triptofaanopname glikolise in longkankerselle bevorder.Ons studie beklemtoon die waarde van serummetabolietbiomerkers in die beoordeling van die risiko van pulmonale nodules wat deur CT opgespoor word.
Vroeë diagnose is van kritieke belang om oorlewingsyfers vir kankerpasiënte te verbeter.Resultate van die Amerikaanse Nasionale Lung Cancer Screening Trial (NLST) en die Europese NELSON-studie het getoon dat sifting met lae-dosis rekenaartomografie (LDCT) longkankersterftes in hoërisikogroepe aansienlik kan verminder1,2,3.Sedert die wydverspreide gebruik van LDCT vir longkanker-sifting, het die voorkoms van toevallige radiografiese bevindings van asimptomatiese pulmonale nodules steeds toegeneem 4 .Pulmonêre nodules word gedefinieer as fokale ondeursigtighede tot 3 cm in deursnee 5 .Ons ondervind probleme om die waarskynlikheid van maligniteit te bepaal en om die groot aantal pulmonale nodules wat toevallig op LDCT opgespoor is, te hanteer.Beperkings van CT kan lei tot gereelde opvolgondersoeke en vals-positiewe resultate, wat lei tot onnodige ingryping en oorbehandeling6.Daarom is daar 'n behoefte om betroubare en bruikbare biomerkers te ontwikkel om longkanker in die vroeë stadiums korrek te identifiseer en die meeste goedaardige nodules by aanvanklike opsporing 7 te onderskei.
Omvattende molekulêre analise van bloed (serum, plasma, mononukleêre selle van perifere bloed), insluitend genomika, proteomika of DNA-metilering8,9,10, het gelei tot groeiende belangstelling in die ontdekking van diagnostiese biomerkers vir longkanker.Intussen meet metabolomika-benaderings sellulêre eindprodukte wat deur endogene en eksogene aksies beïnvloed word en word dus toegepas om siekteaanvang en -uitkoms te voorspel.Vloeistofchromatografie-tandem massaspektrometrie (LC-MS) is 'n wyd gebruikte metode vir metabolomika studies as gevolg van sy hoë sensitiwiteit en groot dinamiese omvang, wat metaboliete met verskillende fisies-chemiese eienskappe kan dek11,12,13.Alhoewel globale metabolomiese analise van plasma/serum gebruik is om biomerkers wat verband hou met longkankerdiagnose14,15,16,17 en behandelingsdoeltreffendheid te identifiseer, moet 18 serummetabolietklassifiseerders om tussen goedaardige en kwaadaardige longnodules te onderskei nog baie bestudeer word.-massiewe navorsing.
Adenokarsinoom en plaveiselkarsinoom is die twee hoofsubtipes van nie-kleinselle longkanker (NSCLC).Verskeie CT-siftingstoetse dui aan dat adenokarsinoom die mees algemene histologiese tipe longkanker1,19,20,21 is.In hierdie studie het ons ultra-prestasie vloeistofchromatografie-hoë-resolusie massaspektrometrie (UPLC-HRMS) gebruik om metabolomika-analise op 'n totaal van 695 serummonsters uit te voer, insluitend gesonde kontroles, goedaardige pulmonêre nodules en CT-bespeurde ≤3 cm.Sifting vir stadium I long-adenokarsinoom.Ons het 'n paneel van serummetaboliete geïdentifiseer wat long-adenokarsinoom van goedaardige nodules en gesonde kontroles onderskei.Wegverrykingsanalise het aan die lig gebring dat abnormale triptofaan- en glukosemetabolisme algemene veranderinge in long-adenokarsinoom is in vergelyking met goedaardige nodules en gesonde kontroles.Laastens het ons 'n serum metaboliese klassifiseerder met hoë spesifisiteit en sensitiwiteit gevestig en bekragtig om te onderskei tussen kwaadaardige en goedaardige pulmonêre nodules wat deur LDCT opgespoor word, wat kan help met vroeë differensiële diagnose en risiko-assessering.
In die huidige studie is geslags- en ouderdom-ooreenstemmende serummonsters retrospektief versamel van 174 gesonde kontroles, 292 pasiënte met goedaardige pulmonale nodules en 229 pasiënte met stadium I long-adenokarsinoom.Demografiese kenmerke van die 695 proefpersone word in Aanvullende Tabel 1 getoon.
Soos getoon in Figuur 1a, is 'n totaal van 480 serummonsters, insluitend 174 gesonde kontrole (HC), 170 benigne nodules (BN) en 136 stadium I long adenokarsinoom (LA) monsters, by Sun Yat-sen Universiteit Kanker Sentrum versamel.Ontdekkingskohort vir onbedoelde metabolomiese profilering deur gebruik te maak van ultra-prestasie vloeistofchromatografie-hoë-resolusie massaspektrometrie (UPLC-HRMS).Soos getoon in Aanvullende Figuur 1, is differensiële metaboliete tussen LA en HC, LA en BN geïdentifiseer om 'n klassifikasiemodel te vestig en differensiële padanalise verder te verken.104 monsters wat deur Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum ingesamel is en 111 monsters wat deur twee ander hospitale versamel is, is onderskeidelik aan interne en eksterne validering onderwerp.
'n Studiepopulasie in die ontdekkingskohort wat globale serummetabolomika-analise ondergaan het deur ultra-prestasie vloeistofchromatografie-hoë-resolusie massaspektrometrie (UPLC-HRMS) te gebruik.b Gedeeltelike kleinste-kwadrate-diskriminant-analise (PLS-DA) van die totale metaboloom van 480 serummonsters van die studiekohort, insluitend gesonde kontroles (HC, n = 174), benigne nodules (BN, n = 170) en stadium I long-adenokarsinoom (Los Angeles, n = 136).+ESI, positiewe elektrosproei-ionisasiemodus, -ESI, negatiewe elektrosproei-ionisasiemodus.c–e Metaboliete met aansienlik verskillende abundansies in twee gegewe groepe (twee-stert Wilcoxon getekende rangtoets, vals ontdekking koers aangepas p waarde, FDR <0.05) word in rooi (vou verandering > 1.2) en blou (vou verandering < 0.83) getoon. .) op die vulkaangrafika gewys.f Hiërargiese groepering-hittekaart wat beduidende verskille in die aantal geannoteerde metaboliete tussen LA en BN toon.Brondata word verskaf in die vorm van brondatalêers.
Die totale serummetaboloom van 174 HC, 170 BN en 136 LA in die ontdekkingsgroep is met behulp van UPLC-HRMS-analise ontleed.Ons wys eerstens dat gehaltebeheer (QC) monsters styf saamgroepeer in die middel van 'n nie-toesig hoofkomponent analise (PCA) model, wat die stabiliteit van die huidige studie se prestasie bevestig (Aanvullende Figuur 2).
Soos getoon in die gedeeltelike kleinste-kwadrate-diskriminante analise (PLS-DA) in Figuur 1 b, het ons gevind dat daar duidelike verskille was tussen LA en BN, LA en HC in positiewe (+ESI) en negatiewe (-ESI) elektrosproei-ionisasiemodusse .geïsoleer.Geen betekenisvolle verskille is egter gevind tussen BN en HC in +ESI en -ESI toestande nie.
Ons het 382 differensiële kenmerke tussen LA en HC gevind, 231 differensiële kenmerke tussen LA en BN, en 95 differensiële kenmerke tussen BN en HC (Wilcoxon ondertekende rangtoets, FDR <0.05 en meervoudige verandering >1.2 of <0.83) (Figuur .1c-e) )..Pieke is verder geannoteer (Aanvullende Data 3) teen 'n databasis (mzCloud/HMDB/Chemspider-biblioteek) deur m/z-waarde, retensietyd en fragmentasiemassaspektrumsoektog (besonderhede beskryf in Metodes-afdeling) 22 .Laastens is 33 en 38 geannoteerde metaboliete met beduidende verskille in oorvloed geïdentifiseer vir LA teenoor BN (Figuur 1f en Aanvullende Tabel 2) en LA teenoor HC (Aanvullende Figuur 3 en Aanvullende Tabel 2), onderskeidelik.Daarteenoor is slegs 3 metaboliete met beduidende verskille in oorvloed in BN en HC geïdentifiseer (Aanvullende Tabel 2), in ooreenstemming met die oorvleueling tussen BN en HC in PLS-DA.Hierdie differensiële metaboliete dek 'n wye reeks biochemikalieë (Aanvullende Figuur 4).Gesamentlik toon hierdie resultate beduidende veranderinge in die serummetaboloom wat kwaadaardige transformasie van vroeë stadium longkanker weerspieël in vergelyking met goedaardige longnodules of gesonde vakke.Intussen dui die ooreenkoms van die serummetaboloom van BN en HC daarop dat goedaardige pulmonale nodules baie biologiese eienskappe met gesonde individue kan deel.Gegewe dat epidermale groeifaktor reseptor (EGFR) geenmutasies algemeen voorkom in long adenokarsinoom subtipe 23, het ons probeer om die impak van drywer mutasies op die serum metaboloom te bepaal.Ons het toe die algehele metabolomiese profiel van 72 gevalle met EGFR-status in die long-adenokarsinoomgroep ontleed.Interessant genoeg het ons vergelykbare profiele gevind tussen EGFR-mutantpasiënte (n = 41) en EGFR-wildtipe pasiënte (n = 31) in PCA-analise (Aanvullende Figuur 5a).Ons het egter 7 metaboliete geïdentifiseer waarvan die oorvloed aansienlik verander is in pasiënte met EGFR-mutasie in vergelyking met pasiënte met wilde-tipe EGFR (t-toets, p < 0.05 en vouverandering > 1.2 of < 0.83) (Aanvullende Figuur 5b).Die meerderheid van hierdie metaboliete (5 uit 7) is asielkarnitiene, wat 'n belangrike rol speel in vetsuuroksidasieweë.
Soos geïllustreer in die werkvloei wat in Figuur 2a getoon word, is biomerkers vir nodule-klassifikasie verkry deur gebruik te maak van die minste absolute krimpoperateurs en seleksie gebaseer op 33 differensiële metaboliete wat in LA (n = 136) en BN (n = 170) geïdentifiseer is.Beste kombinasie van veranderlikes (LASSO) - binêre logistiese regressiemodel.Tienvoudige kruisvalidering is gebruik om die betroubaarheid van die model te toets.Veranderlike seleksie en parameterregulasie word aangepas deur 'n waarskynlikheidsmaksimeringsboete met parameter λ24.Globale metabolomika-analise is verder onafhanklik uitgevoer in die interne validerings- (n = 104) en eksterne validerings- (n = 111) groepe om die klassifikasieprestasie van die diskriminantmodel te toets.As gevolg hiervan is 27 metaboliete in die ontdekkingsstel geïdentifiseer as die beste diskriminantmodel met die grootste gemiddelde AUC-waarde (Fig. 2b), waaronder 9 verhoogde aktiwiteit en 18 verminderde aktiwiteit in LA in vergelyking met BN (Fig. 2c).
Werkvloei vir die bou van 'n pulmonale nodule-klassifiseerder, insluitend die keuse van die beste paneel van serummetaboliete in die ontdekkingsstel met behulp van 'n binêre logistiese regressiemodel via tienvoudige kruisvalidering en die evaluering van voorspellende prestasie in interne en eksterne valideringsstelle.b Kruisvalideringstatistieke van LASSO-regressiemodel vir metaboliese biomerkerseleksie.Die getalle hierbo verteenwoordig die gemiddelde aantal biomerkers wat by 'n gegewe λ geselekteer is.Die rooi stippellyn verteenwoordig die gemiddelde AUC-waarde by die ooreenstemmende lambda.Grys foutstawe verteenwoordig die minimum en maksimum AUC-waardes.Die stippellyn dui die beste model met die 27 geselekteerde biomerkers aan.AUC, area onder die ontvanger bedryfskenmerk (ROC) kurwe.c Vou veranderinge van 27 geselekteerde metaboliete in die LA-groep in vergelyking met die BN-groep in die ontdekkingsgroep.Rooi kolom – aktivering.Die blou kolom is 'n afname.d–f Ontvanger bedryfskenmerk (ROC) kurwes wat die krag van die diskriminantmodel toon gebaseer op 27 metabolietkombinasies in die ontdekking, interne en eksterne validasiestelle.Brondata word verskaf in die vorm van brondatalêers.
'n Voorspellingsmodel is geskep op grond van die geweegde regressiekoëffisiënte van hierdie 27 metaboliete (Aanvullende Tabel 3).ROC-analise gebaseer op hierdie 27 metaboliete het 'n oppervlakte onder die kurwe (AUC) waarde van 0.933 opgelewer, ontdekkingsgroep sensitiwiteit was 0.868 en spesifisiteit was 0.859 (Fig. 2d).Intussen, onder die 38 geannoteerde differensiële metaboliete tussen LA en HC, het 'n stel van 16 metaboliete 'n AUC van 0.902 bereik met 'n sensitiwiteit van 0.801 en spesifisiteit van 0.856 om LA van HC te onderskei (Aanvullende Figuur 6a-c).AUC-waardes gebaseer op verskillende vouveranderingsdrempels vir differensiële metaboliete is ook vergelyk.Ons het gevind dat die klassifikasiemodel die beste gevaar het om tussen LA en BN (HC) te onderskei wanneer die vouveranderingsvlak op 1.2 versus 1.5 of 2.0 gestel is (Aanvullende Figuur 7a,b).Die klassifikasiemodel, gebaseer op 27 metabolietgroepe, is verder in interne en eksterne kohorte bekragtig.Die AUC was 0.915 (sensitiwiteit 0.867, spesifisiteit 0.811) vir interne validering en 0.945 (sensitiwiteit 0.810, spesifisiteit 0.979) vir eksterne validering (Fig. 2e, f).Om interlaboratoriumdoeltreffendheid te bepaal, is 40 monsters van die eksterne kohort in 'n eksterne laboratorium ontleed soos beskryf in die Metodes-afdeling.Die klassifikasie akkuraatheid het 'n AUC van 0,925 behaal (Aanvullende Figuur 8).Omdat longplaveiselkarsinoom (LUSC) die tweede mees algemene subtipe van nie-kleinselle longkanker (NSCLC) is na longadenokarsinoom (LUAD), het ons ook die gevalideerde potensiële bruikbaarheid van metaboliese profiele getoets.BN en 16 gevalle van LUSC.Die AUC van diskriminasie tussen LUSC en BN was 0.776 (Aanvullende Figuur 9), wat swakker vermoë aandui in vergelyking met diskriminasie tussen LUAD en BN.
Studies het getoon dat die grootte van nodules op CT-beelde positief gekorreleer is met die waarskynlikheid van maligniteit en bly 'n belangrike determinant van nodule behandeling25,26,27.Ontleding van data van die groot kohort van die NELSON-siftingstudie het getoon dat die risiko van maligniteit in proefpersone met nodusse <5 mm selfs soortgelyk was aan dié in proefpersone sonder nodusse 28 .Daarom is die minimum grootte wat gereelde CT-monitering vereis 5 mm, soos aanbeveel deur die British Thoracic Society (BTS), en 6 mm, soos aanbeveel deur die Fleischner Society 29.Nodules groter as 6 mm en sonder ooglopende benigne kenmerke, genoem onbepaalde pulmonêre nodules (IPN), bly egter 'n groot uitdaging in evaluering en bestuur in kliniese praktyk30,31.Ons het vervolgens ondersoek of knopgrootte metabolomiese handtekeninge beïnvloed met behulp van saamgevoegde monsters van die ontdekking en interne validasie-kohorte.Met die fokus op 27 gevalideerde biomerkers, het ons eers die PCA-profiele van HC- en BN-sub-6 mm-metabolome vergelyk.Ons het gevind dat die meeste van die datapunte vir HC en BN oorvleuel, wat toon dat serummetabolietvlakke soortgelyk was in beide groepe (Fig. 3a).Die kenmerkkaarte oor verskillende groottereekse het in BN en LA bewaar gebly (Fig. 3b, c), terwyl 'n skeiding tussen kwaadaardige en goedaardige nodules in die 6-20 mm-reeks waargeneem is (Fig. 3d).Hierdie kohort het 'n AUC van 0.927, spesifisiteit van 0.868 en sensitiwiteit van 0.820 gehad vir die voorspelling van die kwaadaardigheid van nodules wat 6 tot 20 mm meet (Fig. 3e, f).Ons resultate toon dat die klassifiseerder metaboliese veranderinge wat veroorsaak word deur vroeë kwaadaardige transformasie kan vasvang, ongeag die nodule grootte.
ad Vergelyking van PCA-profiele tussen gespesifiseerde groepe gebaseer op 'n metaboliese klassifiseerder van 27 metaboliete.CC en BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.in LA 6–20 mm teenoor LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm en LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Ontvanger bedryfskenmerk (ROC) kurwe wat diskriminante modelwerkverrigting vir nodules 6–20 mm toon.f Waarskynlikheidswaardes is bereken op grond van die logistiese regressiemodel vir nodules wat 6–20 mm meet.Die grys stippellyn verteenwoordig die optimale afsnywaarde (0,455).Die getalle hierbo verteenwoordig die persentasie gevalle wat vir Los Angeles geprojekteer word.Gebruik 'n tweekantige Student se t-toets.PCA, hoofkomponent-analise.AUC-area onder die kromme.Brondata word verskaf in die vorm van brondatalêers.
Vier monsters (ouderdom 44-61 jaar) met soortgelyke pulmonale nodule-groottes (7-9 mm) is verder geselekteer om die prestasie van die voorgestelde maligniteitsvoorspellingsmodel te illustreer (Fig. 4a, b).Met aanvanklike sifting het Geval 1 voorgestel as 'n soliede knobbel met verkalking, 'n kenmerk wat met benigniteit geassosieer word, terwyl Geval 2 as 'n onbepaalde gedeeltelik soliede knobbel voorgehou het sonder duidelike goedaardige kenmerke.Drie rondes van opvolg CT-skanderings het getoon dat hierdie gevalle stabiel gebly het oor 'n 4-jaar tydperk en is dus as benigne nodules beskou (Fig. 4a).In vergelyking met kliniese evaluering van seriële CT-skanderings, het enkelskoot serummetabolietanalise met die huidige klassifiseerdermodel hierdie goedaardige nodules vinnig en korrek geïdentifiseer op grond van probabilistiese beperkings (Tabel 1).Figuur 4b in geval 3 toon 'n nodule met tekens van pleurale terugtrekking, wat meestal met maligniteit geassosieer word32.Geval 4 aangebied as 'n onbepaalde gedeeltelik soliede nodule met geen bewyse van 'n goedaardige oorsaak nie.Al hierdie gevalle is volgens die klassifiseerdermodel as kwaadaardig voorspel (Tabel 1).Die assessering van long-adenokarsinoom is gedemonstreer deur histopatologiese ondersoek na longreseksie-chirurgie (Fig. 4b).Vir die eksterne valideringsstel het die metaboliese klassifiseerder twee gevalle van onbepaalde longnodules groter as 6 mm akkuraat voorspel (Aanvullende Figuur 10).
CT-beelde van die aksiale venster van die longe van twee gevalle van benigne nodules.In geval 1 het CT-skandering na 4 jaar 'n stabiele soliede nodule van 7 mm getoon met verkalking in die regter onderlob.In geval 2 het CT-skandering na 5 jaar 'n stabiele, gedeeltelik soliede nodule met 'n deursnee van 7 mm in die regter boonste lob aan die lig gebring.b Aksiale venster CT beelde van die longe en ooreenstemmende patologiese studies van twee gevalle van stadium I adenokarsinoom voor longreseksie.Geval 3 het 'n nodule met 'n deursnee van 8 mm in die regter boonste lob met pleurale terugtrekking geopenbaar.Geval 4 het 'n gedeeltelik soliede gemaalde glasnodule van 9 mm in die linker boonste lob geopenbaar.Hematoksilien en eosien (H&E) kleuring van resekseerde longweefsel (skaalbalk = 50 μm) wat die asinêre groeipatroon van longadenokarsinoom demonstreer.Pyle dui nodules aan wat op CT-beelde opgespoor is.H&E beelde is verteenwoordigende beelde van veelvuldige (>3) mikroskopiese velde wat deur die patoloog ondersoek is.
Saamgevat demonstreer ons resultate die potensiële waarde van serummetabolietbiomerkers in die differensiële diagnose van pulmonale nodules, wat uitdagings kan inhou wanneer CT-sifting geëvalueer word.
Gebaseer op 'n gevalideerde differensiële metabolietpaneel, het ons probeer om biologiese korrelate van groot metaboliese veranderinge te identifiseer.KEGG-wegverrykingsanalise deur MetaboAnalyst het 6 algemene aansienlik veranderde paaie tussen die twee gegewe groepe geïdentifiseer (LA vs. HC en LA vs. BN, aangepas p ≤ 0,001, effek > 0,01).Hierdie veranderinge is gekenmerk deur versteurings in piruvaatmetabolisme, triptofaanmetabolisme, niasien- en nikotinamiedmetabolisme, glikolise, die TCA-siklus en purienmetabolisme (Fig. 5a).Ons het dan verder geteikende metabolomika uitgevoer om groot veranderinge te verifieer met behulp van absolute kwantifisering.Bepaling van algemene metaboliete in algemeen veranderde weë deur drievoudige kwadrupool massaspektrometrie (QQQ) met behulp van outentieke metabolietstandaarde.Demografiese kenmerke van die metabolomika-studie-teikenmonster is ingesluit in Aanvullende Tabel 4. In ooreenstemming met ons globale metabolomika-resultate, het kwantitatiewe analise bevestig dat hipoksantien en xantien, piruvaat en laktaat in LA verhoog is in vergelyking met BN en HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Geen betekenisvolle verskille in hierdie metaboliete is egter tussen BN en HC gevind nie.
KEGG-wegverrykingsanalise van aansienlik verskillende metaboliete in die LA-groep in vergelyking met die BN- en HC-groepe.'n Tweestert Globaltest is gebruik, en p-waardes is aangepas deur gebruik te maak van die Holm-Bonferroni-metode (aangepas p ≤ 0,001 en effekgrootte > 0,01).b–d Viool plotte wat hipoksantien-, xantien-, laktaat-, piruvaat- en triptofaanvlakke in serum HC, BN en LA toon, bepaal deur LC-MS/MS (n = 70 per groep).Wit en swart stippellyne dui onderskeidelik die mediaan en kwartiel aan.e Viool plot wat genormaliseerde Log2TPM (transkripsies per miljoen) mRNA uitdrukking van SLC7A5 en QPRT in long adenokarsinoom (n = 513) toon in vergelyking met normale longweefsel (n = 59) in die LUAD-TCGA datastel.Die wit blokkie verteenwoordig die interkwartielreeks, die horisontale swart lyn in die middel stel die mediaan voor, en die vertikale swart lyn wat vanaf die blokkie strek, verteenwoordig die 95% vertrouensinterval (CI).f Pearson korrelasie plot van SLC7A5 en GAPDH uitdrukking in long adenokarsinoom (n = 513) en normale longweefsel (n = 59) in die TCGA datastel.Die grys area verteenwoordig die 95% CI.r, Pearson-korrelasiekoëffisiënt.g Genormaliseerde sellulêre triptofaanvlakke in A549-selle getransfekteer met niespesifieke shRNA-beheer (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bepaal deur LC-MS/MS.Statistiese ontleding van vyf biologies onafhanklike monsters in elke groep word aangebied.h Sellulêre vlakke van NADt (totale NAD, insluitend NAD+ en NADH) in A549-selle (NC) en SLC7A5-afbreek A549-selle (Sh1, Sh2).Statistiese ontleding van drie biologies onafhanklike monsters in elke groep word aangebied.i Glikolitiese aktiwiteit van A549-selle voor en na SLC7A5-afslag is gemeet deur ekstrasellulêre versuringtempo (ECAR) (n = 4 biologies onafhanklike monsters per groep).2-DG,2-deoksie-D-glukose.Tweestert Student se t-toets is in (b–h) gebruik.In (g–i), verteenwoordig foutstawe die gemiddelde ± SD, elke eksperiment is drie keer onafhanklik uitgevoer en die resultate was soortgelyk.Brondata word verskaf in die vorm van brondatalêers.
Met inagneming van die beduidende impak van veranderde triptofaanmetabolisme in die LA-groep, het ons ook serum-triptofaanvlakke in die HC-, BN- en LA-groepe beoordeel deur gebruik te maak van QQQ.Ons het gevind dat serum triptofaan in LA verminder is in vergelyking met HC of BN (p < 0,001, Figuur 5d), wat ooreenstem met vorige bevindings dat sirkulerende triptofaanvlakke laer is in pasiënte met longkanker as in gesonde kontroles van die kontrolegroep33,34 ,35.Nog 'n studie wat PET/CT-spoorsnyer 11C-metiel-L-tryptofaan gebruik het, het bevind dat die triptofaanseinretensietyd in longkankerweefsel aansienlik verhoog is in vergelyking met benigne letsels of normale weefsel36.Ons veronderstel dat die afname in triptofaan in LA-serum aktiewe triptofaanopname deur longkankerselle kan weerspieël.
Dit is ook bekend dat die eindproduk van die kynurenienweg van triptofaankatabolisme NAD+37,38 is, wat 'n belangrike substraat is vir die reaksie van gliseraldehied-3-fosfaat met 1,3-bisfosfogliseraat in glikolise39.Terwyl vorige studies gefokus het op die rol van triptofaankatabolisme in immuunregulering, het ons probeer om die wisselwerking tussen triptofaan-disregulering en glikolitiese weë wat in die huidige studie waargeneem is, toe te lig.Losstof vervoerder familie 7 lid 5 (SLC7A5) is bekend as 'n triptofaan vervoerder43,44,45.Kinoliensuurfosforibosieltransferase (QPRT) is 'n ensiem wat stroomaf van die kynurenienweg geleë is wat kinoliensuur na NAMN46 omskakel.Inspeksie van die LUAD TCGA-datastel het aan die lig gebring dat beide SLC7A5 en QPRT aansienlik opgereguleer is in tumorweefsel in vergelyking met normale weefsel (Fig. 5e).Hierdie toename is waargeneem in stadiums I en II sowel as stadiums III en IV van longadenokarsinoom (Aanvullende Figuur 11), wat vroeë versteurings in triptofaanmetabolisme wat met tumorgenese geassosieer word, aandui.
Daarbenewens het die LUAD-TCGA-datastel 'n positiewe korrelasie tussen SLC7A5 en GAPDH mRNA-uitdrukking in kankerpasiëntmonsters getoon (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figuur 5f).Daarteenoor is geen beduidende korrelasie tussen sulke geen-handtekeninge in normale longweefsel gevind nie (r = 0.25, p = 0.06, Figuur 5f).Afbreek van SLC7A5 (Aanvullende Figuur 12) in A549-selle het sellulêre triptofaan- en NAD(H)-vlakke aansienlik verminder (Figuur 5g,h), wat gelei het tot verswakte glikolitiese aktiwiteit soos gemeet deur ekstrasellulêre versuringtempo (ECAR) (Figuur 1).5i).Dus, gebaseer op metaboliese veranderinge in serum en in vitro-opsporing, veronderstel ons dat triptofaanmetabolisme NAD+ deur die kynurenienweg kan produseer en 'n belangrike rol speel in die bevordering van glikolise in longkanker.
Studies het getoon dat 'n groot aantal onbepaalde pulmonale nodules wat deur LDCT opgespoor word, kan lei tot die behoefte vir bykomende toetse soos PET-CT, longbiopsie en oorbehandeling as gevolg van 'n vals-positiewe diagnose van maligniteit.31 Soos getoon in Figuur 6, ons studie het 'n paneel van serummetaboliete met potensiële diagnostiese waarde geïdentifiseer wat risikostratifikasie en daaropvolgende bestuur van pulmonale nodules wat deur CT opgespoor kan word, kan verbeter.
Pulmonale nodules word geëvalueer deur gebruik te maak van lae-dosis rekenaartomografie (LDCT) met beeldingskenmerke wat dui op goedaardige of kwaadaardige oorsake.Die onsekere uitkoms van nodules kan lei tot gereelde opvolgbesoeke, onnodige ingrypings en oorbehandeling.Die insluiting van serummetaboliese klassifiseerders met diagnostiese waarde kan risikobepaling en daaropvolgende hantering van pulmonale nodules verbeter.PET positron emissie tomografie.
Data van die Amerikaanse NLST-studie en die Europese NELSON-studie dui daarop dat sifting van hoërisikogroepe met lae-dosis rekenaartomografie (LDCT) longkankersterftes kan verminder1,3.Risikobepaling en daaropvolgende kliniese bestuur van groot getalle toevallige pulmonale nodules wat deur LDCT opgespoor word, bly egter die mees uitdagende.Die hoofdoel is om die korrekte klassifikasie van bestaande LDCT-gebaseerde protokolle te optimaliseer deur betroubare biomerkers in te sluit.
Sekere molekulêre biomerkers, soos bloedmetaboliete, is geïdentifiseer deur longkanker met gesonde kontroles te vergelyk15,17.In die huidige studie het ons gefokus op die toepassing van serummetabolomika-analise om te onderskei tussen goedaardige en kwaadaardige pulmonêre nodules wat toevallig deur LDCT opgespoor is.Ons het die globale serummetaboloom van gesonde beheer (HC), benigne longnodules (BN) en stadium I long adenokarsinoom (LA) monsters vergelyk met behulp van UPLC-HRMS analise.Ons het gevind dat HC en BN soortgelyke metaboliese profiele gehad het, terwyl LA beduidende veranderinge getoon het in vergelyking met HC en BN.Ons het twee stelle serummetaboliete geïdentifiseer wat LA van HC en BN onderskei.
Die huidige LDCT-gebaseerde identifikasieskema vir benigne en kwaadaardige nodules is hoofsaaklik gebaseer op die grootte, digtheid, morfologie en groeitempo van nodules oor tyd30.Vorige studies het getoon dat die grootte van nodules nou verwant is aan die waarskynlikheid van longkanker.Selfs by hoërisikopasiënte is die risiko van maligniteit in nodusse <6 mm <1%.Die risiko van kwaadaardigheid vir nodules wat 6 tot 20 mm meet, wissel van 8% tot 64%30.Daarom beveel die Fleischner Vereniging 'n afsnydiameter van 6 mm aan vir roetine-CT-opvolging.29 Risikobepaling en bestuur van onbepaalde pulmonale nodules (IPN) groter as 6 mm is egter nie voldoende uitgevoer nie 31 .Huidige hantering van aangebore hartsiektes is gewoonlik gebaseer op waaksame wag met gereelde CT-monitering.
Gebaseer op die gevalideerde metaboloom, het ons vir die eerste keer die oorvleueling van metabolomiese handtekeninge tussen gesonde individue en benigne nodules <6 mm gedemonstreer.Die biologiese ooreenkoms stem ooreen met vorige CT-bevindinge dat die risiko van kwaadaardigheid vir nodules <6 mm so laag is as vir proefpersone sonder nodusse.30 Daar moet kennis geneem word dat ons resultate ook aantoon dat benigne nodules <6 mm en ≥6 mm hoog het ooreenkoms in metabolomiese profiele, wat daarop dui dat die funksionele definisie van benigne etiologie konsekwent is, ongeag die nodule grootte.Dus, moderne diagnostiese serummetabolietpanele kan 'n enkele toets as 'n uitskakelingstoets verskaf wanneer nodules aanvanklik op CT opgespoor word en potensieel reeksmonitering verminder.Terselfdertyd het dieselfde paneel van metaboliese biomerkers kwaadaardige nodules ≥6 mm in grootte van benigne nodules onderskei en akkurate voorspellings verskaf vir IPNs van soortgelyke grootte en dubbelsinnige morfologiese kenmerke op CT-beelde.Hierdie serummetabolismeklassifiseerder het goed gevaar in die voorspelling van die kwaadaardigheid van nodules ≥6 mm met 'n AUC van 0,927.Saamgevat dui ons resultate daarop dat unieke serum metabolomiese handtekeninge spesifiek vroeë tumor-geïnduseerde metaboliese veranderinge kan weerspieël en potensiële waarde het as risikovoorspellers, onafhanklik van knopgrootte.
Veral long-adenokarsinoom (LUAD) en plaveiselcelkarsinoom (LUSC) is die hooftipes nie-kleinselle longkanker (NSCLC).Aangesien LUSC sterk geassosieer word met tabakgebruik47 en LUAD die mees algemene histologie van toevallige longnodules is wat op CT-sifting48 opgespoor word, is ons klassifiseerdermodel spesifiek gebou vir stadium I adenokarsinoommonsters.Wang en kollegas het ook op LUAD gefokus en nege lipied-handtekeninge geïdentifiseer deur lipidomics te gebruik om vroeë-stadium longkanker van gesonde individue te onderskei17.Ons het die huidige klassifiseerdermodel getoets op 16 gevalle van stadium I LUSC en 74 benigne nodules en lae LUSC voorspelling akkuraatheid waargeneem (AUC 0.776), wat daarop dui dat LUAD en LUSC hul eie metabolomiese handtekeninge kan hê.Daar is inderdaad getoon dat LUAD en LUSC verskil in etiologie, biologiese oorsprong en genetiese afwykings49.Daarom moet ander tipes histologie ingesluit word in opleidingsmodelle vir bevolkingsgebaseerde opsporing van longkanker in siftingsprogramme.
Hier het ons die ses mees gereelde veranderde weë in long-adenokarsinoom geïdentifiseer in vergelyking met gesonde kontroles en goedaardige nodules.Xanthine en hipoksantien is algemene metaboliete van die purienmetaboliese pad.In ooreenstemming met ons resultate, was tussenprodukte wat met purienmetabolisme geassosieer word, aansienlik verhoog in die serum of weefsels van pasiënte met long-adenokarsinoom in vergelyking met gesonde kontroles of pasiënte in die pre-indringende stadium15,50.Verhoogde serumxantien- en hipoksantienvlakke kan die anabolisme weerspieël wat deur vinnig prolifererende kankerselle vereis word.Disregulering van glukosemetabolisme is 'n bekende kenmerk van kankermetabolisme51.Hier het ons 'n beduidende toename in piruvaat en laktaat in die LA-groep waargeneem in vergelyking met die HC- en BN-groep, wat ooreenstem met vorige verslae van glikolitiese wegafwykings in die serummetaboloomprofiele van nie-kleinselle longkanker (NSCLC) pasiënte en gesonde beheermaatreëls.die resultate is konsekwent52,53.
Dit is belangrik dat ons 'n omgekeerde korrelasie tussen piruvaat- en triptofaanmetabolisme in die serum van long-adenokarsinome waargeneem het.Serum triptofaanvlakke was verlaag in die LA groep in vergelyking met die HC of BN groep.Interessant genoeg, 'n vorige grootskaalse studie met behulp van 'n voornemende kohort het bevind dat lae vlakke van sirkulerende triptofaan geassosieer word met 'n verhoogde risiko van longkanker 54 .Triptofaan is 'n noodsaaklike aminosuur wat ons geheel en al uit voedsel kry.Ons kom tot die gevolgtrekking dat serum triptofaan-uitputting in long-adenokarsinoom vinnige uitputting van hierdie metaboliet kan weerspieël.Dit is welbekend dat die eindproduk van triptofaankatabolisme via die kynurenienweg die bron van de novo NAD+ sintese is.Omdat NAD+ hoofsaaklik deur die reddingsweg geproduseer word, moet die belangrikheid van NAD+ in triptofaanmetabolisme in gesondheid en siekte bepaal word46.Ons analise van die TCGA databasis het getoon dat die uitdrukking van die triptofaan vervoerder opgeloste stof vervoerder 7A5 (SLC7A5) aansienlik verhoog is in long adenokarsinoom in vergelyking met normale kontroles en was positief gekorreleer met die uitdrukking van die glikolitiese ensiem GAPDH.Vorige studies het hoofsaaklik gefokus op die rol van triptofaankatabolisme in die onderdrukking van die antitumor immuunrespons40,41,42.Hier demonstreer ons dat inhibisie van triptofaan-opname deur afbreek van SLC7A5 in longkankerselle 'n daaropvolgende afname in sellulêre NAD-vlakke en 'n gepaardgaande verswakking van glikolitiese aktiwiteit tot gevolg het.Samevattend bied ons studie 'n biologiese basis vir veranderinge in serummetabolisme wat verband hou met kwaadaardige transformasie van longadenokarsinoom.
EGFR-mutasies is die mees algemene drywermutasies by pasiënte met NSCLC.In ons studie het ons gevind dat pasiënte met EGFR-mutasie (n = 41) algehele metabolomiese profiele het soortgelyk aan pasiënte met wilde-tipe EGFR (n = 31), alhoewel ons verlaagde serumvlakke van sommige EGFR-mutante pasiënte in asielkarnitienpasiënte gevind het.Die gevestigde funksie van asielkarnitiene is om asielgroepe vanaf die sitoplasma na die mitochondriale matriks te vervoer, wat lei tot die oksidasie van vetsure om energie te produseer 55 .In ooreenstemming met ons bevindinge, het 'n onlangse studie ook soortgelyke metaboloomprofiele tussen EGFR-mutant- en EGFR-wildtipe gewasse geïdentifiseer deur die globale metaboloom van 102 long-adenokarsinoomweefselmonsters te ontleed50.Interessant genoeg is asielkarnitieninhoud ook in die EGFR-mutantgroep gevind.Daarom, of veranderinge in asielkarnitienvlakke EGFR-geïnduseerde metaboliese veranderinge en die onderliggende molekulêre weë weerspieël, kan verdere studie verdien.
Ten slotte, ons studie vestig 'n serum metaboliese klassifiseerder vir die differensiële diagnose van pulmonale nodules en stel 'n werkvloei voor wat risiko-assessering kan optimaliseer en kliniese bestuur kan fasiliteer gebaseer op CT-skandering sifting.
Hierdie studie is goedgekeur deur die Etiese Komitee van Sun Yat-sen Universiteit Kanker Hospitaal, die Eerste Geaffilieerde Hospitaal van Sun Yat-sen Universiteit, en die Etiek Komitee van Zhengzhou Universiteit Kanker Hospitaal.In die ontdekkings- en interne valideringsgroepe is 174 sera van gesonde individue en 244 sera van benigne nodules versamel van individue wat jaarlikse mediese ondersoeke by die Departement van Kankerbeheer en -voorkoming, Sun Yat-sen University Cancer Centre, en 166 benigne nodules ondergaan het.serum.Stadium I long-adenokarsinome is van Sun Yat-sen Universiteit Kanker Sentrum versamel.In die eksterne valideringskohort was daar 48 gevalle van benigne nodules, 39 gevalle van stadium I longadenokarsinoom van die Eerste Geaffilieerde Hospitaal van Sun Yat-sen Universiteit, en 24 gevalle van stadium I longadenokarsinoom van Zhengzhou Kanker Hospitaal.Sun Yat-sen Universiteit Kanker Sentrum het ook 16 gevalle van stadium I plaveiselcellongkanker ingesamel om die diagnostiese vermoë van die gevestigde metaboliese klassifiseerder te toets (pasiënteienskappe word in Aanvullende Tabel 5 getoon).Monsters van die ontdekkingskohort en interne validasie-kohort is tussen Januarie 2018 en Mei 2020 ingesamel. Monsters vir die eksterne validering-kohort is tussen Augustus 2021 en Oktober 2022 versamel. Om geslagsvooroordeel te minimaliseer, is ongeveer gelyke getalle manlike en vroulike gevalle aan elkeen toegeken. kohort.Discovery-span en interne hersieningspan.Deelnemer geslag is bepaal op grond van selfrapportering.Ingeligte toestemming is van alle deelnemers verkry en geen vergoeding is verskaf nie.Proefpersone met benigne nodules was diegene met 'n stabiele CT-skandering telling op 2 tot 5 jaar ten tyde van analise, behalwe vir 1 geval van die eksterne valideringsmonster, wat preoperatief versamel en deur histopatologie gediagnoseer is.Met die uitsondering van chroniese brongitis.Long adenokarsinoom gevalle is ingesamel voor longreseksie en bevestig deur patologiese diagnose.Vaste bloedmonsters is in serum skeidingsbuise sonder enige antikoagulante versamel.Bloedmonsters is vir 1 uur by kamertemperatuur gestol en dan gesentrifugeer by 2851 × g vir 10 minute by 4°C om serumsupernatant te versamel.Serum aliquots is by -80°C gevries tot metaboliet ekstraksie.Die Departement van Kankervoorkoming en Mediese Ondersoek van die Sun Yat-sen Universiteit Kankersentrum het 'n poel serum van 100 gesonde skenkers ingesamel, insluitend 'n gelyke aantal mans en vroue tussen die ouderdomme van 40 en 55 jaar.Gelyke volumes van elke skenkermonster is gemeng, die resulterende poel is verdeel en by -80°C gestoor.Die serummengsel is as verwysingsmateriaal vir kwaliteitbeheer en datastandaardisering gebruik.
Verwysingserum en toetsmonsters is ontdooi en metaboliete is met 'n gekombineerde ekstraksiemetode (MTBE/metanol/water) 56 onttrek.Kortliks, 50 μl serum is gemeng met 225 μl yskoue metanol en 750 μl yskoue metiel-tert-butiel-eter (MTBE).Roer die mengsel en inkubeer op ys vir 1 uur.Die monsters is dan gemeng en vortex gemeng met 188 μl MS-graad water wat interne standaarde bevat (13C-laktaat, 13C3-piruvaat, 13C-metionien en 13C6-isoleucine, gekoop van Cambridge Isotope Laboratories).Die mengsel is dan gesentrifugeer by 15 000 × g vir 10 minute by 4 ° C, en die onderste fase is oorgedra in twee buise (125 μL elk) vir LC-MS analise in positiewe en negatiewe modusse.Uiteindelik is die monster in 'n hoëspoed-vakuumkonsentrator tot droog verdamp.
Die gedroogde metaboliete is in 120 μl 80% asetonitriel hersaamgestel, vir 5 min gevorteks en by 15 000 × g vir 10 min by 4°C gesentrifugeer.Supernatante is oorgedra in amber glas flessies met mikroinserts vir metabolomika studies.Ongedoelde metabolomika-analise op 'n ultra-prestasie vloeistofchromatografie-hoë-resolusie massaspektrometrie (UPLC-HRMS) platform.Metaboliete is geskei met behulp van 'n Dionex Ultimate 3000 UPLC-stelsel en 'n ACQUITY BEH Amide kolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).In positiewe ioonmodus was die mobiele fases 95% (A) en 50% asetonitril (B), wat elk 10 mmol/L ammoniumasetaat en 0.1% mieresuur bevat het.In negatiewe modus het mobiele fases A en B onderskeidelik 95% en 50% asetonitril bevat, beide fases bevat 10 mmol/L ammoniumasetaat, pH = 9. Die gradiëntprogram was soos volg: 0-0.5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1–20 min, 2% B. Die kolom is by 40°C gehou en die monster by 10°C in die outomonsternemer.Die vloeitempo was 0.3 ml/min, die inspuitvolume was 3 μl.’n Q-Exactive Orbitrap-massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) met ’n elektrosproei-ionisasie- (ESI) bron is in volle skanderingsmodus bedryf en gekoppel aan die ddMS2 moniteringsmodus om groot volumes data in te samel.Die MS-parameters is soos volg ingestel: spuitspanning +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillêre temperatuur 320°C, skermgas 40 arb, hulpgas 10 arb, sondeverwarmertemperatuur 350°C, skanderingreeks 70–1050 m/h, resolusie.70 000. Data is verkry met behulp van Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Om datakwaliteit te evalueer, is saamgevoegde gehaltebeheer (QC) monsters gegenereer deur 10 μL hoeveelhede van die supernatant uit elke monster te verwyder.Ses kwaliteit kontrole monster inspuitings is aan die begin van die analitiese volgorde ontleed om die stabiliteit van die UPLC-MS stelsel te bepaal.Gehaltebeheermonsters word dan periodiek in die bondel ingebring.Al 11 groepe serummonsters in hierdie studie is deur LC-MS ontleed.Porties van 'n serumpoelmengsel van 100 gesonde skenkers is as verwysingsmateriaal in onderskeie groepe gebruik om die ekstraksieproses te monitor en vir bondel-tot-batch effekte aan te pas.Ongeteikende metabolomika-analise van die ontdekkingskohort, interne validasie-kohort en eksterne validasie-kohort is by die Metabolomika-sentrum van Sun Yat-sen Universiteit uitgevoer.Die eksterne laboratorium van KwaZulu-Natal Universiteit van Tegnologie Analise en Toetssentrum het ook 40 monsters van die eksterne kohort ontleed om die prestasie van die klassifiseerdermodel te toets.
Na ekstraksie en rekonstitusie is absolute kwantifisering van serummetaboliete gemeet deur gebruik te maak van ultrahoë werkverrigting vloeistofchromatografie-tandem massaspektrometrie (Agilent 6495 triple quadrupole) met 'n elektrosproei ionisasie (ESI) bron in meervoudige reaksie monitering (MRM) modus.'n ACQUITY BEH Amiedkolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) is gebruik om metaboliete te skei.Die mobiele fase het bestaan uit 90% (A) en 5% asetonitril (B) met 10 mmol/L ammoniumasetaat en 0.1% ammoniakoplossing.Die gradiëntprogram was soos volg: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min., 0%B.Die kolom is by 40 °C gehou en die monster by 10 °C in die outomonsternemer.Die vloeitempo was 0.3 mL/min en die inspuitvolume was 1 μL.MS-parameters is soos volg gestel: kapillêre spanning ±3.5 kV, verstuiverdruk 35 psi, skedegasvloei 12 L/min, skedegastemperatuur 350°C, drooggastemperatuur 250°C, en drooggasvloei 14 l/min.Die MRM-omsettings van triptofaan, piruvaat, laktaat, hipoksantien en xantien was 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 en 151.0–107.9 onderskeidelik.Data is ingesamel met behulp van Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Vir serummonsters is triptofaan, piruvaat, laktaat, hipoksantien en xantien gekwantifiseer deur gebruik te maak van kalibrasiekurwes van standaardmengseloplossings.Vir selmonsters is triptofaaninhoud genormaliseer na die interne standaard en selproteïenmassa.
Piekekstraksie (m/z en retensietyd (RT)) is uitgevoer met behulp van Compound Discovery 3.1 en TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Om potensiaalverskille tussen groepe uit te skakel, is elke kenmerkende piek van die toetsmonster gedeel deur die kenmerkende piek van die verwysingsmateriaal van dieselfde bondel om die relatiewe oorvloed te verkry.Die relatiewe standaardafwykings van interne standaarde voor en na standaardisering word in Aanvullende Tabel 6 getoon. Verskille tussen die twee groepe is gekenmerk deur valse ontdekkingskoers (FDR<0.05, Wilcoxon ondertekende rangtoets) en vouverandering (>1.2 of <0.83).Rou MS-data van die onttrekte kenmerke en verwysingserum-gekorrigeerde MS-data word onderskeidelik in Aanvullende Data 1 en Aanvullende Data 2 getoon.Piekaantekening is uitgevoer op grond van vier gedefinieerde vlakke van identifikasie, insluitend geïdentifiseerde metaboliete, vermoedelik geannoteerde verbindings, vermoedelik gekarakteriseerde verbindingsklasse en onbekende verbindings 22 .Gebaseer op databasissoektogte in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), is biologiese verbindings met MS/MS wat ooreenstem met gevalideerde standaarde of presiese passing annotasies in mzCloud (telling > 85) of Chemspider uiteindelik gekies as tussenprodukte tussen die differensiële metaboloom.Piekaantekeninge vir elke kenmerk is ingesluit in Aanvullende Data 3. MetaboAnalyst 5.0 is gebruik vir eenveranderlike analise van som-genormaliseerde metaboliet oorvloed.MetaboAnalyst 5.0 het ook KEGG-wegverrykingsanalise geëvalueer gebaseer op aansienlik verskillende metaboliete.Hoofkomponent-analise (PCA) en gedeeltelike kleinste-kwadrate-diskriminant-analise (PLS-DA) is ontleed deur die ropls-sagtewarepakket (v.1.26.4) met stapelnormalisering en outoskaling te gebruik.Die optimale metaboliet biomerker model vir die voorspelling van nodule maligniteit is gegenereer met behulp van binêre logistiese regressie met die minste absolute krimping en seleksie operateur (LASSO, R pakket v.4.1-3).Die prestasie van die diskriminantmodel in die opsporing- en valideringsstelle is gekenmerk deur die skatting van AUC gebaseer op ROC-analise volgens die pROC-pakket (v.1.18.0.).Die optimale waarskynlikheid-afsnypunt is verkry gebaseer op die maksimum Youden-indeks van die model (sensitiwiteit + spesifisiteit - 1).Monsters met waardes minder of groter as die drempel sal onderskeidelik as benigne nodules en long-adenokarsinoom voorspel word.
A549 selle (#CCL-185, American Type Culture Collection) is gekweek in F-12K medium wat 10% FBS bevat.Kort haarnaald-RNA (shRNA)-volgordes wat SLC7A5 teiken en 'n nie-teikenkontrole (NC) is in die lentivirale vektor pLKO.1-puro ingevoeg.Die antisense volgordes van shSLC7A5 is soos volg: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Teenliggaampies teen SLC7A5 (#5347) en tubulien (#2148) is van Cell Signaling Technology gekoop.Teenliggaampies teen SLC7A5 en tubulien is gebruik teen 'n verdunning van 1:1000 vir Western klad analise.
Die Seahorse XF Glycolytic Stress Test meet ekstrasellulêre versuring (ECAR) vlakke.In die toets is glukose, oligomisien A en 2-DG opeenvolgend toegedien om sellulêre glikolitiese kapasiteit te toets soos gemeet deur ECAR.
A549-selle wat getransfekteer is met nie-teikenbeheer (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) is oornag in 10 cm deursnee skottelgoed uitgeplaat.Selmetaboliete is met 1 ml yskoue 80% waterige metanol onttrek.Selle in die metanoloplossing is afgeskraap, in 'n nuwe buis versamel en by 15 000 × g vir 15 minute by 4°C gesentrifugeer.Versamel 800 µl supernatant en droog met 'n hoëspoed-vakuumkonsentrator.Die gedroogde metabolietkorrels is dan geanaliseer vir triptofaanvlakke deur gebruik te maak van LC-MS/MS soos hierbo beskryf.Sellulêre NAD(H)-vlakke in A549-selle (NC en shSLC7A5) is gemeet deur gebruik te maak van 'n kwantitatiewe NAD+/NADH kolorimetriese stel (#K337, BioVision) volgens die vervaardiger se instruksies.Proteïenvlakke is vir elke monster gemeet om die hoeveelheid metaboliete te normaliseer.
Geen statistiese metodes is gebruik om die steekproefgrootte voorlopig te bepaal nie.Vorige metabolomika-studies gemik op biomerker-ontdekking15,18 is as maatstawwe vir groottebepaling beskou, en in vergelyking met hierdie verslae was ons steekproef voldoende.Geen monsters is uit die studiekohort uitgesluit nie.Serummonsters is ewekansig toegewys aan 'n ontdekkingsgroep (306 gevalle, 74.6%) en 'n interne valideringsgroep (104 gevalle, 25.4%) vir ongeteikende metabolomika-studies.Ons het ook lukraak 70 gevalle uit elke groep gekies uit die ontdekkingsstel vir geteikende metabolomika-studies.Die ondersoekers was verblind vir groepopdrag tydens LC-MS-data-insameling en -analise.Statistiese ontledings van metabolomika-data en sel-eksperimente word in die onderskeie Resultate, Figuurlegendes en Metodes afdelings beskryf.Kwantifisering van sellulêre triptofaan, NADT en glikolitiese aktiwiteit is drie keer onafhanklik uitgevoer met identiese resultate.
Vir meer inligting oor die studie-ontwerp, sien die Natural Portfolio Report Abstract wat met hierdie artikel geassosieer word.
Die rou MS-data van die onttrekte kenmerke en die genormaliseerde MS-data van die verwysingserum word onderskeidelik in Aanvullende Data 1 en Aanvullende Data 2 getoon.Piekaantekeninge vir differensiële kenmerke word in Aanvullende Data 3 aangebied. Die LUAD TCGA-datastel kan afgelaai word vanaf https://portal.gdc.cancer.gov/.Die insetdata vir die plot van die grafiek word in die brondata verskaf.Brondata word vir hierdie artikel verskaf.
Nasionale Longsiftingstudiegroep, ens. Vermindering van longkankersterftes met lae-dosis rekenaartomografie.Noord-Engeland.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR en Prophet, PC Longkanker-sifting met behulp van lae-dosis heliese CT: resultate van die National Long Screening Study (NLST).J. Med.Skerm 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Vermindering van longkankersterftes met volumetriese CT-sifting in 'n gerandomiseerde proef.Noord-Engeland.J. Med.382, 503–513 (2020).
Postyd: 18-Sep-2023